[发明专利]抗菌肽NX-16及其制备方法与应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种抗菌肽，具体涉及一种抗菌肽NX-16及其制备方法与应用。

背景技术

抗菌肽是生物体内经诱导产生的一种具有生物活性的小分子多肽，通常含有15-45个氨基酸残基。这类活性多肽多数具有强碱性、热稳定性以及广谱抗菌等特点。世界上第一个抗菌肽是由瑞典科学家G. Boman 等人于1980年从天蚕蛹中发现的。而后，人们相继从细菌、真菌、两栖类、昆虫、高等植物、哺乳动物乃至人类中发现并分离获得具有抗菌活性的多肽。最初，人们发现这类活性多肽对细菌具有广谱高效杀菌活性。随着人们研究工作的深入开展，发现某些抗细菌肽对部分真菌、原虫、病毒、肿瘤细胞或癌细胞等均具有强有力的杀伤作用，某些抗菌肽还具有免疫调节功能。

抗生素的滥用不仅导致了药物残留等公共卫生问题，而且因耐药菌株的出现，使得细菌性疾病的防治再次成为困扰人类的难题。同时国家有关法律规定，多种抗生素被禁用或限用。由于抗菌肽的广谱的高效的抗菌活性及其独特的抗菌机制而在新型抗菌药物研究中已经显露出明显优势。特别是对抗菌肽基因表达调控机制认识的不断深化，结合现代基因工程技术，可设计出在医药工业和畜牧业上更有效的抗菌肽。因此，抗菌肽可作为抗生素的良好替代品在临床上得到广泛的使用将是大势所趋。

目前，许多抗菌肽正在被开发成药物，但是抗菌肽天然产量非常低，合成肽价格又相当昂贵，这些成为开发抗菌肽类药物的一个瓶颈。基因工程表达技术可以高效表达生物活性蛋白，而且操作简单、成本低。因此，通过基因工程技术生产抗菌肽具有广阔的应用前景。通过对基因工程抗菌肽进行合理的改造和突变，进一步增加其抑菌和杀菌活性，研究其作用机制以及结构和功能的关系对畜牧业和抗生素替代药物的生产实践具有重要的指导意义。

目前，诸多研究者将抗菌肽基因表达方法多集中于真核表达系统。曾有报道称采用大肠杆菌表达系统以融合蛋白的形式表达出抗菌肽，但结果不是十分理想。同时，有研究者提出这样的问题，即大肠杆菌表达出的抗菌肽对大肠杆菌本身具有一定的杀灭作用，会影响到抗菌肽的表达。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供了一种具有抗菌活性的抗菌肽NX-16，构建了含有目的基因的重组表达载体，并公开了采用原核表达系统表达重组的抗菌肽基因，再通过酶解法获得抗菌肽NX-16的制备方法，该方法表达效率高，分离纯化简单，易操作，稳定性好。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：

一种抗菌肽NX-16，它是具有序列表中SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的多肽，或是由SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列经环化、N末端和/或C末端的修饰、L－型氨基酸和D－型氨基酸互相转变、序列末端缺失中的至少一种处理而得到的功能等同物的多肽。

一种多核苷酸，其核苷酸序列：

（a）编码SEQ ID NO：1所示的多肽的多核苷酸；或为

（b）与多核苷酸（a）互补的多核苷酸。

一种含有上述核苷酸的载体。

一种含有上述载体的遗传工程化的宿主细胞。

所述抗菌肽NX-16的制备方法包括如下步骤：

（1）将序列表中SEQ ID NO：1所示氨基酸序列按3个重复进行串联，并根据大肠杆菌密码子的偏爱性，设计该串联氨基酸序列的串联基因，分别在两端再加入核酸限制性内切酶识别位点和保护性碱基，形成待表达的目的基因；

（2）针对上述目的基因，利用SOEingPCR引物设计方法设计四条互补的引物，四条引物中含有重叠碱基片段，运用重叠区扩增拼接PCR法合成目的基因；

（3）将目的基因和原核表达载体pET30a(+)双酶切后进行连接，转化大肠杆菌BL21，并进行鉴定；

（4）用IPTG进行诱导表达，菌体经超声破碎，用SDS-PAGE分析表达产物；

（5）表达产物经透析、复性后，用激肽释放酶酶解，获得抗菌肽NX-16。

所述目的基因序列如SEQ ID NO：2所示。

所述四条互补的引物的序列如SEQ ID NO：3～6所示。

一种能与所述抗菌肽NX-16特异性结合的抗体。

一种药物组合物，含有安全有效量的权利要求1所述的抗菌肽NX-16以及医学上可接受的载体。

所述抗菌肽NX-16在制备杀菌剂中的应用。

本发明具有积极有益的效果：