[发明专利]一种农杆菌介导的纵切幼苗上胚轴顶端转化大豆的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种农杆菌介导的利用纵切幼苗上胚轴顶端转化大豆的方法。

背景技术

大豆是重要的的食用和油料作物。大豆含丰富的植物蛋白，营养价值极高。大豆油中不饱和脂肪酸和维生素E含量丰富，是世界上最重要的植物油。随着世界人口的增长及人们生活水平的提高，人们对大豆的需求量越来越大。常规育种已不能满足人们对大豆品种和品质的要求。随着现代分子生物学的发展和进步，利用转基因技术培育大豆新品种已经成为一种趋势。

将人工分离和修饰过的基因导入到生物体基因组中，由于导入基因的表达，引起生物体的性状的可遗传的修饰，这一技术称之为转基因技术。目前用于大豆育种的转基因技术主要包括两大类，第一类是不需要经过组织培养的转基因技术，目前研究比较多的是花粉管通道法；另一类是需要经过组织培养的转基因技术，比较常用的有基因枪法和农杆菌介导法。

（一）  花粉管通道法

花粉管通道法是在授粉后向子房注射含目的基因的DNA 溶液,利用植物在开花、受精过程中形成的花粉管通道,将外源DNA 导入受精卵细胞,并进一步地被整合到受体细胞的基因组中,随着受精卵的发育而成为携带转基因的新个体。花粉管通道法不需要组织培养和仪器转化设备，简便易行,但需要育种工作者摸索具体的外源DNA 导入时间与方法。

（二）  基因枪法

基因枪法是将直径很小的钨粉或金粉粒子微粒浸泡在供体DNA 中,使外源基因吸附在表面,然后用基因枪以很高的速度将金属微粒射入受体植物细胞内实施转化。该方法的主要优点是不受受体植物范围的限制,其载体质粒的构建也相对简单,因此也是目前转基因研究中应用较为广泛的一种方法。但是基因枪法需要经过组织培养阶段，受到组织培养条件的限制，转基因周期长，成本比较高。另一方面由于基因枪法的随机性，外源基因进入宿主基因组的整合位点相对不固定，拷贝数往往较多，这样转基因后代容易出现突变、外源基因容易丢失，容易引起基因沉默等现象的发生，不利于外源基因在宿主植物的稳定表达。而且基因枪价格昂贵、运转费用高。这些都限制了基因枪作为产业化转基因技术的广泛使用。

（三）  农杆菌介导法

农杆菌介导法是现代转基因领域广泛使用的一种技术，其优点是手段相对简单,可靠性强,效率高。但在只有外植体能再生的双子叶植物中才能采用。目前，农杆菌介导法应用于大豆转化主要是以大豆的子叶、子叶节等为外植体，利用农杆菌侵染，然后经过组织培养再生器官，获得转基因苗。大豆转化的效率受到农杆菌菌株感染转化能力、大豆基因型、组织培养条件、T - DNA 的转移效率和转化后的筛选模式的影响，很难大面积推广。

    本发明提供了一种全新的、无需经过组织培养阶段的农杆菌介导的大豆转化方法，具有比较高的实际应用价值和推广前景。

发明内容

本发明的目的是提供一种农杆菌介导的纵切幼苗上胚轴顶端转化大豆的转基因方法，包括以下步骤：

（a）、浸泡大豆，光照保湿条件下培养至下胚轴长2～3cm。

（b）、将含有目的基因的农杆菌用渗透培养基悬浮，所述渗透培养基含有细胞分裂素KT、植物生长素2,4-D、抗氧化剂DTT和L-Cysteine。

（c）、在渗透培养基中，用薄刀刃在大豆的上胚轴顶端纵切，制造伤口。

 （d）、致伤处理后的大豆幼苗浸没在渗透培养基中培养。

（e）、农杆菌侵染后的大豆幼苗在吸水纸上吸干水分，种入土中。

使用纵切幼苗上胚轴顶端转化大豆时，会导致大部分植株发生褐变腐烂死亡的现象，严重影响了植株生长及结实率与转化率。这种外植体的褐化可能是植物对受伤和病原体侵害的一种防御反应。我们在渗透培养基里添加了DTT和L-Cysteine，这两种抗氧化剂可以有效的减少外植体的褐化现象，提高农杆菌的感染率。本发明还首次在渗透培养基里添加了生长素2,4-D和激动素(KT)，这两种添加剂能够显著提高大豆的转化效率。

本发明中，上述渗透培养基中2,4-D的最佳浓度为0.5-5mg/L、KT的最佳浓度为0.1-4mg/L、DTT的最佳浓度为0.5-5mM/L、 L-Cysteine的最佳浓度为100～400mg/L。

本发明中用薄刀刃在大豆的上胚轴顶端纵切，制造伤口，具体为：顺大豆两子叶夹缝，划伤上胚轴顶端外侧，使夹缝向胚轴方向延长，优选延长4～6mm。致伤后的大豆在渗透培养基中28℃、24hr黑暗、130～170rpm培养 15～30min。