[发明专利]利用酵母甘露糖异构酶基因获得转基因拟南芥植物的方法

说明书

技术领域

本发明属于植物转基因技术领域，具体涉及利用来源于酿酒酵母的甘露糖异构酶(PMI)基因(pmi)作为拟南芥转基因的筛选标记，直接在含甘露糖的培养基上对拟南芥种子的萌发状态进行筛选，快速方便。并且在筛选过程中不需要添加抗生素或除草剂，获得的转基因植物也不含抗生素或除草剂基因，因而对人体和环境安全，是一种绿色转基因植物方法。

背景技术

植物基因转化的关键在于用一种合适的选择标记基因把极少数的转化子从未转化细胞中筛选出来，或者是杀死未转化细胞，或者是给转化细胞以生长优势。通常所利用的选择标记基因有；潮霉素抗性基因hpt、卡那霉素抗性基因npt II、除草剂抗性基因bar，这些筛选系统的原理都是未转化细胞被杀死，转化细胞能将筛选剂分解为无毒物质而得以生存繁殖。但这些筛选系统由于使用抗生素或除草剂及其基因，已经引起了社会的广泛争议。为了消除这种不利影响，目前采取的方法有：使用安全选择标记基因，主要有绿色荧光蛋白基因gfp、核糖醇操纵子-rtl、甘露糖磷酸异构酶(phosphomannose-isomerase，PMI)基因pmi、木糖异构酶基因xyl A和谷氨酸-1-半醛转氨酶基因heml(王兴春和杨长登，转基因植物生物安全标记基因.中国生物工程杂志，2003，23(4)：19-22.)；或者消除选择标记基因，包括利用共转化系统、位点重组系统、λ噬菌体插入/切割系统，以及转座子转座消除选择标记基因(Barbara et al.Elimination of selection markers from transgenic plants.Current Opinion in Biotechnology，2001，2：139-143.)。

磷酸甘露糖异构酶(phosphomannose-isomerase，PMI)基因pmi(是最近发展起来的一种正向选择标记基因。自然界中PMI基因广泛存在于细菌、酵母、动物和人类。在植物中除了肉桂和其他一些豆科植物外，都没有PMI基因(Lee and Matheson，Phosphomannoisomerase and phosphoglucoisomerase in seeds of Cassia coluteoides and some other legumes that synthesize galactomannan.Phytochem，1984，23：983-987.)，因此，PMI基因可以作为选择标记应用于植物基因转化。

目前，植物基因转化中所利用的PMI基因都是来自于大肠杆菌。此筛选系统以PMI基因为选择标记基因，以甘露糖为筛选剂。1987年Malca等发现植物细胞不能在以甘露糖为碳源的培养基上正常生长分化。当植物细胞在含有甘露糖的培养基中生长时，植物细胞从培养基中吸收甘露糖，并在己糖激酶的作用下将甘露糖磷酸化为6-磷酸甘露糖，不含PMI基因的细胞不能进一步利用6-磷酸甘露糖，6-磷酸甘露糖的积累一方面会消耗细胞内的无机磷酸(Sheu-Hwa et al.，Stimulation of photosynthetic starch formation by sequestration of cytoplasmic orthophosphate.New Phytol，1975，74：383-392.)，另一方面会抑制葡萄糖磷酸异构酶而阻碍糖酵解过程(Goldsworthy and Street，The carbohydrate nutrition of tomato roots VIII.The mechan-ism of the inhibition by D-mannose of the respiration of excised roots.Ann Bot，1965，29：45-58.)，这就使未转化的细胞在含有甘露糖的培养基上发生碳饥饿不能正常生长。而转化的细胞含PMI基因，在甘露糖磷酸异构酶PMI的作用下将6-磷酸甘露糖转化为6-磷酸果糖，6-磷酸果糖能够参与糖酵解而被进一步利用，这样就使转化细胞能够以甘露糖为碳源，在含有甘露糖的培养基上正常生长，而获得代谢优势(Joersbo et al.，Analysis of mannose selection used for transformation of sugar beet.Mol Breed，1998，4：111-117.)。