[发明专利]一种微囊藻毒素荧光标记的方法

说明书

技术领域

本发明涉及藻毒素的荧光标记方法，具体涉及一种微囊藻毒素-半胱氨酸-异硫氰酸酯(MC-Cys-FITC)的制备方法。利用荧光标记的藻毒素与激光扫描共聚焦显微技术联合应用，可以直接观察到藻毒素在生物体内聚集的位置、转运的途径，为研究藻毒素在生物体内的转运途径奠定一定基础。

背景技术

随着水体污染逐渐加重，出现富营养化而导致的蓝藻水华日趋普遍，水体环境中的微囊藻毒素(microcystins，MCs)污染已成为大家高度关注的环境问题。MCs是由蓝藻产生的一种二级代谢物，具有强烈致癌作用，其分子结构复杂、性质稳定，传统的处理工艺难以有效祛除，这对人类健康构成了极大的威胁，因此对深入进行在微囊藻毒素毒理学方面的研究成为关注人类健康的迫切需要，目前主要集中在微囊藻毒素的肝受体、毒素的转运原理、毒素作用的分子机理尤其是促肿瘤的分子机制等方面的研究，但都是间接的对微囊藻毒素毒理学进行研究，缺乏足够的实验证据。因此，急需一种能够直接显示微囊藻毒素在生物体内聚集的位置、转运途径以及分子机理的新方法。

发明内容

本发明的目的是在于提供了一种微囊藻毒素(MC-LR)荧光标记的方法，方法易行，操作简便，具体来说是使用半胱氨酸(Cys)作为中间连接体将微囊藻毒素和异硫氰酸荧光素(FITC)连接在一起，对微囊藻毒素进行荧光标记。采用本发明的标记方法能够有效的将MC-LR和FITC连接在一起，并能得到纯度为95％的MC-Cys-FITC，为微囊藻毒素毒理学方面的研究提供直接实验证据。

为了实现上述的目的，本发明采用以下技术措施：

一种微囊藻毒素(MC-LR)荧光标记的方法，其步骤是：

A、在pH9-13的充氮气保护并室温(20-30℃以下相同)震荡的条件下，将微囊藻毒素(MC-LR)与半胱氨酸以1∶20的摩尔比在5％的K₂CO₃溶液中反应9-11h，得到微囊藻毒素的半胱氨酸衍生物(MC-Cys)；

B、通过高效液相色谱仪(HPLC)并设置一定的制备色谱条件进行纯化，除去反应液中过量的半胱氨酸，得到纯化的MC-Cys；

C、将纯化后的MC-Cys与异硫氰酸荧光素(FITC)以1∶2的摩尔比在硼酸盐缓冲液中反应，pH 8.5-9.5，在室温下振荡反应9-11h，得到偶联FITC的藻毒素MC-Cys-FITC；

D、通过高效液相色谱仪(HPLC)并设置一定的制备色谱条件进行纯化，除去反应液中过量的FITC，得到纯化的藻毒素-半胱氨酸-异硫氰酸荧光素的偶合物(MC-Cys-FITC)。

所述的B步骤制备色谱条件是：

流动相：A：H₂O+0.1％TFA；B：ACN+0.1％TFA，流速：15mL/min，检测波长：238nm，进样量30mL，检测器：可见紫外分光检测器，制备柱：XTerra Prep MS C₁₈ Column(19×50mm)，HPLC色谱分离梯度条件如表1：

表1色谱分离梯度条件

所述的D步骤制备色谱条件是：

流动相：A：25nM乙酸铵；B：CAN，流速：15mL/min，检测波长：238nm，进样量30mL，检测器：可见紫外分光检测器，制备柱：XTerra Prep MS C₁₈ Column(19×50mm)，HPLC色谱分离梯度条件如表2：

表2色谱分离梯度条件

本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：

其一是半胱氨酸是一种人体必需氨基酸，没有毒性，且分子量较小，有羧基、氨基和巯基这三种功能团能进行反应，将半胱氨酸作为中间连接体将微囊藻毒素和荧光素异硫氰酸酯连接在一起，克服了荧光素与微囊藻毒素不能直接结合的问题。

其二重要的是通过本发明的制备色谱条件进行纯化后，可以得到纯度高达95％的MC-Cys-FITC，从而去除游离的荧光素异硫氰酸酯所带来的干扰。

附图说明

图1为一种微囊藻毒素(MC-LR)的结构图。

图2为一种MC与Cys连接的反应式。

图3为一种MC-Cys与FITC连接的反应式。

图4为一种MC-Cys反应液的色谱图。

图中显示MC-Cys在12.3min出峰，根据面积归一法计算，纯化后的MC-Cys的纯度为94％。