[发明专利]酵母展示脂肪酶催化合成L-抗坏血酸DHA酯的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种酵母展示脂肪酶催化合成L-抗坏血酸DHA酯的方法。

背景技术

BHA、BHT、PG、TBHQ等合成抗氧化剂广泛用于食品工业，但是由于存在致癌，体内消化后有毒性等安全隐患，其食用越来越受质疑，天然抗氧化剂也因此备受青睐。L-抗坏血酸(维生素C)是目前使用最多的天然抗氧化剂之一，随着两步发酵法生产维生素C技术的不断成熟，我国生产维生素C产量已居世界之首，生产成本也相对较低。然而，维生素C是水溶性的天然抗氧化剂，只能在水相体系发挥作用，但食品体系往往是油相或者是多相的，这就大大局限了维生素C的使用范围。将合适的亲油性基团“嫁接”到维生素C上合成脂溶性衍生物，从而改变其亲水性及溶解性可有效解决这一问题。L-抗坏血酸DHA酯是维生素C上“嫁接”DHA的衍生物，DHA(二十二碳六烯酸)属于ε-3系列多不饱和脂肪酸，具有增强免疫、抗癌、抗炎、降血脂、降血压、抗动脉粥样硬化及健脑益智、提高视力等生理功效，但是DHA自身不稳定，容易被氧化或发生自动氧化，从而降低其营养保健价值。通过与维生素C酯化不仅可以提高DHA的稳定性，还可获得集抗氧化、营养性、保健性、乳化性等多种特性为一体，具有很大的市场潜力的新型产品。

目前实现这一“嫁接”有化学法和生物酶法，由于化学法存在转化条件苛刻(强酸、碱催化、高温高压)、无特异性、产物复杂、副产物多、分离难、安全性差等弊端，生物酶法越来越受青睐。脂肪酶是目前维生素酯合成中使用最广泛的酶，但是生产成本高、固定化过程繁杂费时大大局限了其商业化应用。

发明内容

本发明提供了一种酵母展示脂肪酶催化合成L-抗坏血酸DHA酯的方法，可显著降低L-抗坏血酸DHA酯生产成本，同时达到较高的酯化反应效率和产率。

一种酵母展示脂肪酶催化合成L-抗坏血酸DHA酯的方法，包括：

将L-抗坏血酸和DHA溶于有机溶剂中，加入酵母展示脂肪酶，无氧条件下于50～60℃反应4～8小时，分离、纯化制得L-抗坏血酸DHA酯。

优选的，所述的有机溶剂为正己烷和四氢呋喃的混合物，体积比优选为1∶1。

优选的，每升有机溶剂中L-抗坏血酸、DHA和酵母展示脂肪酶的加入量分别为15～35g、150～350g、50～100g。

搅拌速率为150～250转/分钟。

优选的，在分离纯化前加入分子筛，继续搅拌反应10～12h，锁住水分，促进酯化反应进一步进行。

所述的分离、纯化为：离心取上清液，旋转蒸发除去有机溶剂，水洗后溶于正己烷，重结晶。

所述的酵母展示脂肪酶通过如下方法制备：

将经线性化处理的重组质粒转入毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115，将所得转化子接种于BMMY培养基中，诱导培养72～144小时后离心收集菌体，菌体经冲洗、生物印迹和冷冻干燥制得酵母展示脂肪酶；

所述的重组质粒由原始载体pPIC9K和依次插入原始载体pPIC9K中MFα1信号肽下游的脂肪酶基因和毕赤酵母GS115的细胞壁α凝集素基因组成。

所述的脂肪酶基因可选用Genbank号为AF229435的序列，毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115为商业化产品，可从Invitrogen公司购得。它的细胞壁α凝集素基因序列的Genbank号为M28164。

载体pPIC9K为商业化产品(如Invitrogen公司)，它存在MFα1信号肽序列(Genbank号：M17301)，同时该载体内信号肽序列上游存在AOX1启动子(Genbank号：Z46233)。重组质粒线性化处理的目的是为了与胞内基因组发生同源重组，提高表达稳定性。

优选的，所述生物印迹所用配体为油酸，它可以诱导酶结构改变，提高转化率。

本发明通过将脂肪酶基因和细胞壁α凝集素基因导入毕赤酵母细胞GS115，毕赤酵母细胞诱导培养后，脂肪酶表达并分泌到胞外，同时利用细胞壁α凝集素将该脂肪酶固定在细胞表面。利用该酵母展现脂肪酶对酯化反应进行催化，不仅提高了操作稳定性、耐热性以及重复性，而且反应产物单一(为L-抗坏血酸DHA酯)，转化率(以L-抗坏血酸计)在60％以上，产率高达58-60％。

具体实施方式

实施例1制备酵母展示脂肪酶