[发明专利]一种利用组培快速转育质体转基因植株的方法

说明书

技术领域

本发明属于作物遗传育种技术领域，特别是利用组织培养技术快速转育质体转基因植株的方法。

背景技术

高等植物的成熟质体根据颜色和功能的不同，可分为叶绿体、有色体和白色体三类，在一定条件下可以相互转化。质体基因组与细胞核基因组之间既相互独立,又相互依存。细胞核核基因转化一直是植物基因工程的主要研究方向，但其有难以克服的弊端，例如：细胞核基因组大，背景复杂；导入的外源基因难以控制；外源基因表达效率低，后代不稳定，或发生转基因沉默等，这些问题将严重影响细胞核基因转化技术的实际应用。

质体基因转化技术与核基因转化相比较，表现出它旺盛的生命力，因为它有以下优点: ①高效表达 质体基因组的拷贝数非常大(例如每个叶细胞中含有大约1900～50000 个拷贝) ,整合在其中的外源基因也会以高拷贝数存在,这为外源基因的高效表达提供条件；②转化的原核基因无需修饰改造就可以在高等植物中进行转化。质体大多数基因的结构、转录与翻译系统均与原核生物类似,因此,对于来自原核生物的有重要价值的外源基因,无需改造和修饰就可在质体中转化并高效表达,这是细胞核基因转化无法做到的；③安全性好　大多数植物的叶绿体具有母性遗传的特点，因为在受精过程中，只有花粉细胞核穿过胚珠，花粉的细胞质一般不向后代传递。所以对于大多数植物来说，一旦外源基因插入叶绿体基因组，就不会通过花粉向其它植物中扩散(马三梅和王永飞，2004)），从而保证了基因工程的安全性；④便于遗传操作 质体基因组小，结构简单，烟草、水稻和欧龙牙草等几种高等植物的质体基因组已全被测定，其它植物也有许多质体基因被定位和测序，遗传背景较清楚，便于遗传操作；⑤实现定点整合 外源基因可通过同源重组定点整合进入质体基因组。定点整合有利于控制外源基因的表达，保持植物基因的正常功能；⑥易保持纯系、后代不分离。一旦得到纯合而稳定的质体转化体,由于外源基因的母系遗传特性。这种纯系的种子后代不会因为有性杂交而发生分离，将长时间保持为纯系；⑦叶绿体转化还具有无基因沉默和位置效应等优点。

烟草和棉花等的细胞质雄性不育与叶绿体DNA有关。在叶绿体遗传转化研究方面，已克隆和成功质体转化甜菜叶绿体的rbcL/atpB基因(李滨胜, 崔杰 et al. 2008)。到目前为止，在烟草、拟南芥、马铃薯、番茄、水稻、油菜、棉花、大豆和莴苣等多种作物中进行了叶绿体转化研究并获得成功（李滨胜, 崔杰等，2008）。

尽管如此，质体转基因技术还是难度较大，转化效率偏低，而且还受到材料类型甚至基因型的限制。在育种过程中，育种家通常需要把获得转基因单株的基因转育到其它的优异材料中以获得更多的转基因优异材料。传统做法是将转基因单株与优异材料杂交，然后再与优异材料回交（至少5代以上），直至获得具有转基因材料的细胞质和具有优异材料的几乎相同的细胞核遗传物质。这种转育质体转基因方法通常需要4-5年，成本高、需要大面积种植选择单株，过程繁琐、费力，并且在回交中选择单株的效率还受育种家经验影响。另外传统的质体转基因材料的转育只能在有性杂交成功的材料间进行，对种间及其以上材料直接的转育效率低甚至会失败。

植物细胞与细胞之间的通道为胞间连丝，它有助于每个植物细胞与邻近细胞之间进行分子交换。研究证明植株在幼嫩未成熟组织的状态下，大分子交换的通道更是杂乱无章，植株越嫩，胞间连丝越大，越容易发生大分子甚至细胞器的交换。嫁接杂交能够成为一种简单有效育种的方法(Liu, Wang et al.,2010)，但作为一种基因转移方法很少被应用。Stegemann 和 Bock（2009年，Science 324(5927): 649-51）研究表明遗传物质可以在嫁接结合处穿越。研究表明在烟草嫁接时核DNA(Stegemann and Bock 2009)或者是质体编码基因能够在砧木和接穗细胞之间穿越，并且证明最后融合的细胞中来自两部分的标记基因都会表达，并且遗传物质的传递可以在两个方向上进行；发现74株嫁接小苗有94次事件发生，细胞间基因转移频率与嫁接方向不相关。通过嫁接可以得到可遗传的物质，并且这种方法与有性繁殖没有主要区别(Rusk 2009)。嫁接转移基因可以打破不同物种间基因交流的局限(Stegemann and Bock 2009)。利用嫁接转育质体转基因植株目前还没有被利用。

发明内容