[发明专利]一种利用组培技术快速培育细胞质不育系统中保持系的方法

说明书

技术领域

本发明属于作物遗传育种技术领域，特别是一种利用组培技术快速培育细胞质不育系统中保持系的方法。

背景技术

作物不育系的利用为杂种优势的推广做出了巨大的贡献。杂种优势利用的方法主要有细胞质雄性不育系、细胞核雄性不育系、自交不亲和系、基因工程雄性不育系和化学杀雄等方法。其中细胞质雄性不育也被称为是细胞质和细胞核互作雄性不育系，以下简称为细胞质雄性不育。

有一种类型的细胞质雄性不育系为隐性细胞质雄性不育系，即几乎所有的材料都为其恢复系。育种家要想获得保持系，传统方法是采用洋葱公式人工合成。具体步骤为：通常得到的不育系材料基因型为s(rfrf),自然界中恢复系基因型为N(RfRf)或s(RfRf）,两者之间杂交F1代基因型s(Rfrf)。取F1花粉与恢复系回交后自交，将出现两种情况：（1）若后代出现不育单株，则对应的恢复系的细胞质为不育的，这种情况被淘汰。（2）若后代没有不育单株出现，则对应的恢复系的细胞质为可育，并且反交得到N(Rfrf)和N(RfRf)两种基因型。N(Rfrf)自交出现N(RfRf):N(Rfrf):N(rfrf)=1:2:1的分离比，另一种基因型N(RfRf)自交仍然为N(RfRf)。然后将自交后代的株系与不育系s(rfrf)测交，若出现表型为不育单株，其对应的父本基因型应该为N(rfrf)，这就是我们所需要的保持系。这种方法称为洋葱公式人工合成法。在此过程中需要多代测交、杂交和自交，配制多个测交组合，并且需要大面积种植和多年测定，外加一定的机遇才能成功选育出保持系。

在作物不育系统中，有一种不育类型为微量花粉性雄性不育，如甘蓝型油菜中的Polima雄性不育系和Shan 2A雄性不育系，但在选育过程中会出现微量花粉的程度与保持系的核基因遗传背景有较大关系。在选育保持系时，不育系s（rfrf）要与保持系N(rfrf)进行多年回交。较为彻底的不育系在与保持系回交时通常会出现较多的微量花粉而被淘汰掉。回交次数越多、组合越多越容易出现微量花粉。从数百个测交组合中能够筛选出的优良保持系寥寥无几。多年的测交和回交工作量大，种植面积广，费时费力和过程繁琐。

在传统育种过程中，育种家通常从由不育系配制的优良的杂交组合中分离出优良单株作为育种材料。杂交组合F1代材料基因型为s(Rfrf)，将基因型s(Rfrf)自交，F2代会产生s(RfRf): s(Rfrf):s(rfrf)=1:2:1分离,如果出现优良不育单株也望洋兴叹，只能在可育株及后代中继续选择，直至找到优良性状可育单株，但筛选出的可育单株一定具有Rf基因，所以只能做恢复系，而不育株s(rfrf)会被筛选掉。但并不是每个材料都适合做恢复系，所以此方法育种造成育种材料较大浪费。

嫁接作为一种营养繁殖为众人所知，但作为一种基因转移方法却很少被应用。植物细胞与细胞之间的通道胞间连丝，有助于植物每个细胞与邻近细胞之间进行有利的分子交换(Liu, 2010)，研究证明植株在幼嫩未成熟组织的状态下，大分子交换的通道就更杂乱无章，植株越嫩，胞间连丝越大，发生大分子转移的可能性就越大(Rusk, 2009)。Stegemann and Bock（science, 2009）研究表明细胞质遗传物质如质体DNA编码转基因可以在嫁接结合处相互转移，并且证明转移后的细胞中两种标记基因都会表达而且是可遗传的。嫁接转移质体基因74株嫁接小苗中有94次质体转移事件。通过嫁接转移线粒体研究在育种中较少利用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种利用组培技术快速培育细胞质不育系统中保持系的方法，该方法利用组织培养技术将不育系和具有正常细胞质的可育系材料进行嫁接，两者的愈伤组织细胞中的线粒体相互转移，使具有正常细胞质的可育系的线粒体转移到不育系的细胞质中，然后组培分化长根成苗，通过分子鉴定和表型确认，得到既有不育系细胞核遗传物质又有可育系的正常细胞质材料，此材料即可作为保持系，为育种提供保持系材料。

本发明依次通过下列步骤实现：

1）将细胞质雄性不育系和具有正常细胞质的可育系种子浸泡24h后，依次经清水冲洗2次、质量比浓度为95%的乙醇处理1min 、无菌水清洗2-3次、质量比浓度为0.1%升汞漂洗15min，其间不时摇动、 无菌水清洗4次后，接种于MS培养基，取培养8-10d的幼苗备用；

MS培养基配方： MS粉4.4g /L+糖 20g/L + 冷凝胶 2.6g/L