[发明专利]一种利用组培技术快速培育细胞质不育系统中保持系的方法

权利要求书

1.一种利用组培技术快速培育细胞质不育系统中保持系的方法，其特征在于，依次通过下列步骤实现：

1）将细胞质雄性不育系和具有正常细胞质的可育系种子浸泡24h后，依次经清水冲洗2次、质量比浓度为95%的乙醇处理1min 、无菌水清洗2-3次、质量比浓度为0.1%升汞漂洗15min，其间不时摇动、 无菌水清洗4次后，接种于MS培养基，取培养8-10d的幼苗备用；

MS培养基配方： MS粉4.4g /L+糖 20g/L + 冷凝胶 2.6g/L

2）待种子发芽下胚轴伸长到大约10cm左右时，将不育系下胚轴切成5mm切段，具有正常细胞质的可育系切成10mm切段，然后将两种切段切口处接触放于诱导脱分化培养基；

脱分化培养基配方: MS盐4.41g/L+2,4-D 1mg/L+6-BA 1mg/L +蔗糖30g/L + 冷凝胶2.6g/L

3）伤口处出现愈伤组织的分化后，将其转移至分化培养基上；

分化培养基配方：MS盐4.41g/L +6-BA4mg/L+ZT 2mg/L+AgNO₃ 5mg/L+蔗糖 30g/L +冷凝胶2.6g/L

4）伤口处产生绿色和白色致密的愈伤组织后，再转移到分化芽培养基上，此时两种切段的愈伤组织结合在一起生长；

分化芽培养基配方：MS盐4.41g/L +6-BA 3mg/L+ZT 2mg/L +蔗糖 30g/L +冷凝胶2.6g/L

5）培养基两周更换一次，组织分化出的类似嫩叶的组织达1cm左右高时转移至分化茎培养基中；

分化茎培养基配方：MS盐4.41g/L +6-BA 0.005mg/L +蔗糖 30g/L +冷凝胶2.6g/L

6）分化茎培养基上外植体逐渐生长长成完整的小植株，待其长出4-5片叶、3-4条须根时，打开培养罐，使小植株慢慢适应外界环境， 2-3天后，移出植株，清水将根部培养基洗净，移栽至盛有营养土的盆钵中常规培养；

7）取植株叶片提取细胞核DNA并用蔗糖沉淀差速离心法提取线粒体DNA，进行分子鉴定，具有不育系细胞核遗传物质又有可育系的正常细胞质材料即为保持系；

8）分子鉴定完成后进行田间性状观察进一步确认，可育且农艺性状与不育系相似的材料即为选育出的保持系；

上述方法步骤1-6都在组培条件下进行，外植体光照16h黑暗8h培养，培养基两周换一次。