[发明专利]一种用于体外分离纯化有核细胞的方法和试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及一种用于体外分离纯化骨髓、脐带血或外周血中有核细胞的方法和试剂盒。

背景技术

干细胞是具有自我复制和多向分化潜能的原始细胞，是机体的起源细胞，是形成人体各种组织器官的原始细胞。干细胞可以从骨髓、脐带血和外周血中分离纯化干细胞，单个核细胞常用的分离方法主要有以下几种：6％羟乙基淀粉沉降法、甲基纤维素沉降法、Ficoll分离法、Percoll分离法、3％明胶分离法、氯化铵溶解红细胞法，直接离心法等。常用的单核细胞的分离方法为Ficoll或Percoll直接分离法。即将血液稀释后直接加于分离液上经密度梯度离心获得单个核细胞。Ficoll和Percoil均为常用的淋巴细胞分离液，有人曾对这两种分离液对比研究，认为Ficoll分离获得的单个核细胞最为纯净。

现有技术中从骨髓、脐带血和外周血中分离纯化干细胞的方法存在着干细胞活率及回收率较低等缺点，本研究预实验发现，采用Ficoll和Percoll直接分离法操作时间长、不同批次的Fieoll或Pcrcoll、不同的血液样本、同一样本同样操作，收集的单个核细胞的数量多少不一，影响单个核细胞的稳定收集。

我们的实验通过对比研究认为，采用6％羟乙基淀粉结合Ficoll用于分离血液中单核细胞提高了单核细胞的回收率和活率。

发明内容

本发明提供了一种用于体外分离纯化骨髓、脐带血或外周血中有核细胞的方法和试剂盒以及该试剂盒的使用方法。

本发明所述的试剂盒包括各自隔离包装的沉淀液、纯化液和悬浮液，其中沉淀液是溶于生理盐水的羟乙基淀粉，其重量体积浓度为6％，纯化液是聚蔗糖泛影钠，悬浮液是生理盐水。所谓隔离包装是指沉淀液、纯化液和悬浮液各自密封在互不相通的容器中，优选地，各自独立包装。

本发明所述的试剂盒，其中所述的沉淀液∶纯化液∶悬浮液的体积比为(2-5)∶(3-9)∶1。

本发明的试剂盒其中所述试剂盒中还包括使用说明书，所述说明书载明了所述试剂盒的使用方法，所述方法包括如下步骤：

(1)将经过抗凝处理的骨髓/脐带血/外周血倒入沉淀液试剂瓶中，拧紧瓶盖颠倒混匀5次，拧松瓶盖，静置22-25分钟；

(2)用10ml的移液管将上清液转到50ml的离心管中，每管25ml，尽量不要吸到红细胞沉淀，并配平。

(3)将两个离心管4℃，离心力710xg(转速2000rpm)，5分钟离心，离心完毕后，弃去上清，用手指轻轻震开沉淀，每管加25ml生理盐水重悬细胞。

(4)将纯化液按每管25ml加到另外两个50ml新的离心管中，将第3步中的细胞悬液用移液管缓慢加到纯化液的液面上，保证两种液体之间的液面清晰，然后，4℃，离心力710xg(转速2000rpm)，20分钟离心，关闭离心机刹车功能。

(5)离心后，吸取中间层细胞，加到新的离心管中，用50ml注射用生理盐水稀释，4℃，配平。离心力400xg(转速1500rpm)，8分钟离心洗涤细胞两次。

(6)将洗后的细胞加到悬浮液中，备用。

本发明所述的试剂盒，用于体外分离纯化骨髓/脐带血/外周血中有核细胞。它利用细胞与无机盐离子联合聚集沉淀的原理，采用逆向收集法分离纯化有核细胞。本发明的试剂盒通常在2-8℃保存。

本发明所述的试剂盒，使用的样品类型为骨髓/脐带血/外周血，可以按照通用的方法收集所需的骨髓/脐带血/外周血样本；确保骨髓/脐带血/外周血收集后转入一次性抗凝血袋；骨髓/脐带血/外周血收集后应在6小时内进行分离纯化有核细胞。

本发明所述的试剂盒，回收率可以达到》90％，分离的有核细胞活率≥96％，最大程度地维持了干细胞在体外微环境的恒定。

本发明还公开了所述试剂盒的使用方法，包括如下步骤：

(1)将经过抗凝处理的骨髓/脐带血/外周血倒入沉淀液试剂瓶中，拧紧瓶盖颠倒混匀5次，拧松瓶盖，静置22-25分钟；

(2)用10ml的移液管将上清液转到50ml的离心管中，每管25ml，尽量不要吸到红细胞沉淀，并配平。

(3)将两个离心管4℃，离心力710xg(转速2000rpm)，5分钟离心，离心完毕后，弃去上清，用手指轻轻震开沉淀，每管加25ml生理盐水重悬细胞。

(4)将纯化液按每管25ml加到另外两个50ml新的离心管中，将第3步中的细胞悬液用移液管缓慢加到纯化液的液面上，保证两种液体之间的液面清晰，然后，4℃，离心力710xg(转速2000rpm)，20分钟离心，关闭离心机刹车功能。