[发明专利]8-氧代脱氧鸟苷的检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学和免疫学领域，尤其是涉及一种8-氧代脱氧鸟苷的检测方法。

背景技术

机体在细胞中的线粒体、微粒体、质膜和胞质中的酶系统和非酶系统在代谢过程中，可以产生活性氧自由基。同时机体在受到外源化学物质和电离辐射等条件下也可能产生活性氧自由基。所述活性氧自由基可以与DNA的碱基形成加合物如脱氧鸟苷，所述脱氧鸟苷加合物在羟化酶的作用下，形成羟基脱氧核苷，其中8-氧代脱氧鸟苷(8-oxo-dG)是羟基脱氧核苷羟中的主要一种，全名为8-羟基-2、-脱氧鸟苷(8-oxo-dG)，其化学结构如图1所示。

8-oxo-dG可直接引起基因突变和癌基因表达。如Kuchino等报道：8-羟基脱氧鸟嘌呤具有同任何碱基配对的能力。脱氧鸟嘌呤的C₈被羟基化后，脱氧鸟嘌呤同胞嘧啶特异性配对的能力丧失，导致DNA复制时碱基的错配，从而出现多种基因突变的形式。Wood等曾证实：在大肠杆菌中，8-氧代脱氧鸟苷具有诱导G→T置换的能力。Cheng等也报道：8-氧代脱氧鸟苷可以引起G→T和A→C置换。8-氧代脱氧鸟苷可以引起突变，ras基因激活的主要原因为点突变。Kamiya等^[4]证实：用人工合成的第12位密码子碱基G置换的原癌基因c-Ha-ras转染NTS3T3细胞，可使部分细胞发生恶性转化。在已知的大约20种DNA的加合物中，8-oxo-dG易于检出，且8-oxo-dG与基因突变明显相关，8-oxo-dG已成为研究最多的DNA碱基氧化损伤修复产物，成为研究DNA损伤修复最常用的生物学标志物(Biomarker)。

8-oxo-dG作为内源性或外源性因素对DNA氧化损伤作用的生物标志物，是一种极有前景的生物标志，通过8-oxo-dG的检测可以评估体内氧化损伤和修复的程度。氧化应激与DNA损伤的相互关系，对研究退行性疾病、衰老机制、癌发生机制、环境毒物与氧化应激的关系等具有重要意义，也可以用来评价抗氧化剂治疗DNA氧化损伤的效果。目前8-oxo-dG的检测方法主要有³²P后标记法、免疫荧光组织化学检测法、酶联免疫吸附(ELISA)法、高效液相色谱-电化学法、气质联用分析法和高效毛细管电泳等。

³²P后标记法，³²P后标记技术是20世纪90年代后发展起来的，具有灵敏度高、样品用量少、应用范围广等优点。其操作过程包括：DNA的消化、标记、层析分离、放射自显影。但该方法的特异性有待提高，且容易造成放射性污染。

酶联免疫吸附(ELISA)法，应用单克隆抗体的ELISA法具有很高的灵敏度和很好的重复性。抗8-oxo-dG多克隆抗体的发展和单克隆抗体的使用为免疫亲和柱的发展提供了条件，可以用于分析生物样品，尤其是尿中DNA和RNA的氧化损伤产物。该方法法不用对DNA进行分解处理，不需使用昂贵的仪器，测定时间短，样本预处理程序简单，是一种很有应用价值的方法。

高效液相色谱-电化学检测器分析(HPLC-ECD)法，是将DNA的酶水解样品通过HPLC分离后，使用ECD进行测定。该方法是Floyd等提出的一种定量测定8-oxo-dG的有效方法。HPLC-ECD在检测8-oxo-dG中得到广泛应用，具有较高的灵敏度，其最低检测限大约为1/50核苷，所需样品量少，对机体不会产生损伤性、且选择性好，对组织细胞DNA及尿中8-oxo-dG均可检测，是目前应用广泛、较为成熟的方法。

气质联用分析法(GC-MS)，是一种将气相色谱仪与质谱仪联合使用检测方法，可为DNA损伤中的氧化产物的鉴定提供可靠而明确的数据，其检测下限为1/50核苷。然而由于质谱仪价格昂贵，无法广泛应用于实验室的检测。同时DNA碱基必须首先进行衍生化反应，这一过程容易导致副产物的形成，从而容易产生假阳性的显示结果。

高效毛细管电泳(HPCE)是利用8-oxo-dG与其他脱氧鸟苷在电场中泳动方向和速率的不同而进行分离，应用保留时间而进行定性，通过外标法来进行定量。其优点是进样量小、分离效率高、保留时间短，比HPLC分离更为迅速，使用紫外检测器灵敏度较低，应用电化学检测器则大大提高灵敏度。

上述的多种检测方法中，都存在某些缺陷，如利用效液相色谱-电化学法检测的过程中，存在酶解不完全、生存副产物、放射性污染、检测周期长，且检测成本高，只能局限于很小范围的临床应用。ELISA免疫学方法相比HPLC法存在交叉反应使测定结果偏高。