[发明专利]基于易错PCR技术提高内切葡聚糖酶的活性的方法

权利要求书

1.基于易错PCR技术提高内切葡聚糖酶的活性的方法，其特征在于，包含以下步骤：

A1，获得突变内切葡聚糖酶基因；突变模板的准备：接种一环含有pMD19-T-Cen(构建载体酶切位点为Bgl II，Sph I)质粒的大肠杆菌DH5α于10mL LB(Amp)液体培养基中37℃培养过夜，使用质粒提取试剂盒按说明提取pMD19-T-Cen质粒；提取的质粒通过Bgl II，Sph I双酶切对其进行检测，检测正确后作为易错PCR的模板；通过引物P1：5’-TAATCCAACCCGGAATTCGCAGAGACAAAAACGCCAGTAGC-3’P2：5’-TAGGAAAGGAAAAAAGCGGCCGCCTAATTTGGTTCTGTTCCCCAAA-3’进行易错PCR；反应结束后进行琼脂糖凝胶电泳，使用纯化试剂盒对易错PCR产物进行纯化回收；

A2，内切葡聚糖酶大肠杆菌突变体库的构建；将步骤A1回收的所述易错PCR产物经EcoR I、NotI双酶切后，连接入经过同样EcoR I、NotI双酶切的含有T7lac启动子和氨苄青霉素抗性基因的表达载体pET-32a(+)中；使用化学热击转化的方法，将含有突变的内切葡聚糖酶基因库的表达载体质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，涂布至LB(Amp)平板，即得构建好的突变体库；

A3，高酶活菌株的筛选；将LB(Amp)平板上长出的菌落一一对应转入的LB(Amp)平板和LB(Amp、IPTG、CMC-Na)平板上，转板后将平板置37℃恒温培养箱培养，LB(Amp)平板培养8h后取出放入4℃冰箱保存，LB(Amp、IPTG、CMC-Na)平板继续培养36h，然后采用刚果红染色法观察水解圈的大小，同时每个平板分别以原始菌和不含有内切葡聚糖酶基因的空载体作为阳性和阴性对照；根据水解圈的大小筛选出目的菌株，再对应从LB(Amp)平板上找出目的克隆菌株；初筛出来的阳性克隆子，通过扩大诱导培养，破壁后测定酶活。

A4，高酶活菌株突变基因的分析：复筛出来的酶活提高的菌株用质粒提取试剂盒提取质粒后转入大肠杆菌DH5α，用质粒提取试剂盒提取质粒，酶切验证导入基因的正确性，并挑取阳性菌株送Invitrogen公司测序；对测序结果进行分析，找出突变碱基位点和氨基酸位点，并对催化结构域三级结构进行预测和比较；SDS-PAGE分析表达量的变化。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤A1中的PCR反应参数为：94℃预变性4min，94℃变性1min，51℃退火1min，72℃延伸2min，30个循环后，72℃延伸10min。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤A2中的酶切方法如下：

37℃酶切过夜。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤A2中的大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞的制备方法为：将E.coli BL21划线接种LB平板，37℃培养直至长出单菌落；挑取一个单菌落，接种至含有10mL LB培养基的50mL三角瓶中，37℃，170rpm培养过夜；将上述培养液按1％接种量接种到50mL LB液体培养基中，37℃，170rpm振荡培养1.5-2小时；将培养后的菌液置冰浴中，使培养物冷却到0℃，10min后转移到无菌的50mL离心管中，4℃，4300rpm离心5min，倒掉上清液；向管中加入30mL无菌预冷的0.1mol/L CaCl2-MgCl2溶液重新悬浮菌体，4℃，4300rpm离心8min，去掉上清液；向管中加入2mL无菌预冷的0.1mol/LCaCl2溶液重新悬浮菌体，得到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤A2中所述化学热击转化的方法为：取一支装有100μL E.coli BL21感受态细胞的Ep管，置冰浴中解冻；将所述过夜连接产物全部加入到上述Ep管中，并用加样器轻轻混合均匀；将Ep管冰浴30min；将Ep管放入42℃恒温水浴中热击90-120秒；迅速将Ep管置冰浴中静置5min；向Ep管中加入800μL LB液体培养基置37℃摇床培养60min，使细菌复苏并表达质粒编码的抗生素抗性标记基因；取培养后的菌液200μL用玻棒涂布在LB(Amp)平板上，将平板置37℃恒温培养箱培养直至液体被吸收后，将平板倒置继续培养12-16h后直至单个菌落出现，即为含有突变内切葡聚糖酶基因Cen^ep的突变体库。