[发明专利]一种表达猪2型圆环病毒ORF2基因片段的重组支气管败血波氏杆菌株、疫苗及应用

说明书

技术领域

本发明属于动物细菌基因工程技术领域，具体涉及一种不含抗性标记的表达猪2型圆环病毒ORF2基因片段的重组支气管败血波氏杆菌活疫苗菌株的构建、疫苗制备及应用。

背景技术

支气管败血波氏杆菌(Bordetella Bronchiseptica，Bb)是一种革兰氏阴性菌，其宿主范围广泛，大多数哺乳动物和鸟类都可以被感染。该菌是引起猪萎缩性鼻炎(Atroptic Rhinitis，AR)的主要病原菌之一，单独的Bb常常引起猪只的隐性感染，发病猪临床表现为生长缓慢，育肥延迟，极大地降低了饲料报酬和生产效率；而Bb和产毒素多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida，Pm)共同作用引起的猪萎缩性鼻炎，在临床上以出现鼻炎、鼻甲骨萎缩和生长性能下降为特征。Bb可通过飞沫传播，并经动物的呼吸运动而侵入机体，该菌侵入机体后，能够破坏局部的纤毛或上皮，同时Bb分泌的各种毒素可引起机体呼吸道粘膜上皮细胞发炎、增生和纤毛脱落。如果机体的鼻粘膜出现急性炎症的继续发展，则常有部分粘膜上皮受损脱落，进而鼻粘膜的屏障作用遭到破坏，大量细菌及其毒素就会趁机迅速进入粘膜下组织，造成骨组织明显损伤，引起猪鼻甲骨病变。同时，Bb粘膜上皮细胞受损脱落后可为其它呼吸道病原菌的侵入提供了条件，造成其它多种病原的继发感染，对鼻腔和整个呼吸道造成更严重的损伤(斯特劳，2000)。从而增加猪群呼吸道疾病的发病率和严重程度，造成严重经济损失(Straw et al.，2000；Karen，2000；Borckmeier，2003)。以AR为代表的猪波氏菌病现已遍布养猪业发达国家，已成为猪的重要呼吸道传染病之一(Straw et al.，2000；Dugal et al.，1992；Vecht et al.，1992；Brockmeier，2004；Brockmeier et al.，2000)。由于Bb属猪鼻腔中的一种常在细菌，因此从机体中根除该菌的可能性不大，但是Bb对猪群的危害又不容忽视，所以防制工作就显得尤为重要，目前主要采取综合防控措施控制该菌，其中对猪群进行免疫接种是主要手段。现今市场上已有针对Bb的相关灭活疫苗，但其使用效果并不明显，效力也普遍较低，这可能与Bb灭活苗不能有效引起局部粘膜免疫，不能产生足够的保护性抗体IgA有关(Bercovich et al.，1977；Giles et al.，1982)。另外，有研究报道有部分Bb弱毒疫苗和亚单位苗在研制中，但尚未被大规模临床推广应用(Kruger et al.，1992；Kang et al.，2007)。

猪2型圆环病毒(Porcine circovirus type 2，PCV2)是当前严重危害世界养猪业的重要病原之一。该病毒与猪的多种疾病综合征有关，特别是断奶仔猪多系统衰竭综合征，其临床症状主要表现为进行性消瘦、呼吸道症状、发热、苍白及黄疸等。PCV2基因组全长为1767或1768bp，共编码11个开放阅读框架(Open reading frames，ORFs)，阅读框之间相互重叠，使病毒可以充分利用有限的遗传物质传递大量的遗传信息。ORF2编码病毒的核衣壳(Cap)蛋白，是病毒唯一的结构蛋白，含有234个氨基酸，分子量大小为27.8kDa。由基因组的互补链合成。Cap蛋白转录起始位点在1238位核苷酸，转录产物内含有由119个核苷酸(1238nt-1120nt)组成的非编码前导序列，Cap启动子精确定位于1353nt-1168nt核苷酸区域，与Rep基因有重叠(Mankertz et al.，1998)。Cap蛋白在圆环病毒感染细胞后6-12小时即可表达，在12-24小时定位于细胞核中(Meertset al.，2005)。ORF2基因在圆环病毒中变异比较大，同源性约为70％。Cap蛋白端的41个氨基酸序列高度保守，富含碱性氨基酸(如精氨酸)，编码病毒的核定位信号，与病毒在细胞核内的定位有关，其中第12-18位和第34-41位氨基酸残基对ORF2的定位起着至关重要的作用。Cap蛋白间不存在交叉反应，具有良好的免疫原性，产生的抗体在血清中维持时间长，因此ORF2基因是进行病毒控制和构建重组疫苗的首选基因。PCV2在猪群中的感染率非常高，但多为隐性感染，且主要侵害机体的免疫系统，导致免疫抑制，造成继发感染，给全球养猪业造成巨大的经济损失。目前主要采取疫苗接种的方法控制该病，但PCV2在体外细胞上增殖滴度不高，用全病毒来制备灭活疫苗或弱毒疫苗操作繁琐，成本高，因此DNA疫苗、亚单位疫苗及活载体疫苗等将是研制PCV2疫苗的主要方向。