[发明专利]一种小分子超抗原改造体蛋白及其编码基因与制备和应用

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体说是一种小分子超抗原改造体蛋白及其制备方法和应用。

背景技术

超抗原(superantigen，SAg)是一组由细菌或病毒编码的蛋白质分子，以极低浓度(1～10ng/mL)刺激大部分T细胞增殖，具有超强的增强机体免疫反应功能和一定的抗肿瘤活性。因此，超抗原是一种极好的免疫调节剂和增效剂，可望被开发成潜在的新型抗肿瘤药物，用于肿瘤治疗。

金黄色葡萄球菌肠毒素(Staphylococcal enterotoxins，SEs)是一类具有代表性的微生物外毒素。由于其极强的T细胞激活功能，成为一类典型微生物超抗原，受到人们的广泛重视。近年来，人们在对金黄色葡萄球菌肠毒素(SE)结构、免疫学功能及其抗肿瘤等进行了大量研究工作，其中主要集中在对TSST1、SEA、SEB等的研究方面。

肠毒素C2(SEC2)作为金黄色葡萄球菌肠毒素家族中的一员，国内外对其结构与功能方面的研究至今不多，且已有的研究结论尚不明确。我所首次对SEC2的基因进行了克隆、测序并在靶向融合蛋白研究方面取得了开创性成果，为进一步开展SEC2分子改造及其靶向融合蛋白的研发奠定了基础。因此，为了进一步提高肠毒素C2在未来抗肿瘤方面的开发潜力，很有必要对其进行进一步的深入研究。为此，我们在前期结构与功能研究的基础上对其进行小型化改造，去除非活性区域，保留免疫刺激功能区域。小分子的改造体蛋白较改造前将具有更好的生理屏障穿透性和更小的血清学反应特性，毒性更低。

发明内容

本发明目的在于提供一种小分子超抗原改造体蛋白及其编码基因与制备和应用。

为实现上述目的，本发明的技术方案如下：

所述的小分子超抗原改造体蛋白具有序列表SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6的氨基酸序列。

所述的小分子超抗原改造体蛋白的编码基因具有序列表SEQ ID NO：1、SEQ IDNO：3或SEQ ID NO：5的碱基序列。

所述的小分子超抗原改造体蛋白的制备方法为：

(1)以具有序列表SEQ ID NO：7中碱基序列的SEC2全基因sec2为模板，采用引物对F1：5’-GTTGGAATTCTCAAGTGAGTTTACTGG -3’和R1：5’-CGCCTCGAGTTATAAGTTCCCATTATCAAAG-3’，PCR扩增扩得具有序列表SEQ ID NO：1中碱基序列的sag1突变基因；

以具有序列表SEQ ID NO：7中碱基序列的SEC2全基因sec2为模板，采用引物对F2：5’-CGGAATTCGAGAGTCAACCAGA-3’和R1：5’-CGCCTCGAGTTATAAGTTCCCATTATCAAAG-3’，PCR扩增扩得具有序列表SEQ ID NO：3中碱基序列的sag2突变基因；

以具有序列表SEQ ID NO：7中碱基序列的SEC2全基因sec2为模板，采用引物对F1：5’-GTTGGAATTCTCAAGTGAGTTTACTGG-3’和R2：5’-TCGCTCGAGTTATCCATTCTTTGTTG-3’，PCR扩增扩得具有序列表SEQ ID NO：5中碱基序列的sag3突变基因；

(2)将以上突变基因sag1、sag2或sag3克隆入表达载体pET-28a中，并转化大肠杆菌BL21(DE3)为宿主菌，构建成基因工程菌，经诱导表达并纯化后得到小分子超抗原改造体蛋白。

步骤2)中所述的诱导是以终浓度为1mmol/L异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)为诱导物进行诱导表达。

步骤2)中所述的蛋白分离纯化采用Ni亲和层析法，层析时所用的介质为琼脂糖凝胶树脂，洗脱液成分为10mM Tirs-HCl，0.5M NaCl，250mM咪唑，pH＝7.9。

所述的小分子超抗原改造体蛋白可作为抗肿瘤或免疫调节类的前体药物的活性成分。

本发明所具有如下优点：

1.本发明为人工构建的系列编码小分子超抗原改造体蛋白的核苷酸序列，获知其基因全序列的组成。

2.本发明利用PCR技术，克隆编码小分子超抗原改造体蛋白的核苷酸基因，并在大肠杆菌中表达，表达的小分子超抗原改造体蛋白经检验具有超抗原的生物学活性；应用本发明，可提供直接用于生产该超抗原突变蛋白的基因工程菌株。