[发明专利]用于快速恒温基因突变检测的聚合酶链反应方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物科技和医学领域，具体涉及一种简单、敏感且快速的实时核酸扩增的聚合酶链反应恒温基因扩增方法、以及用于该方法的特殊引物组及试剂盒。

本方面的方法、引物及试剂盒可广泛应用于基础研究和临床诊断中的血液、细胞组织等各种生物样品中特定DNA基因野生型或突变样本的检测(例如包括但不限于EGFR、KRAS、BRAF、PI3K、ALK、C-Kit、PDGFR、ABL或其它癌基因等野生型或突变基因)，也可用于特定基因的恒温扩增。

背景技术

A.基因检测的临床意义

基因检测主要是用于疾病的诊断，疾病的预防和指导个体化用药。例如，对结核杆菌感染的诊断，以前主要依靠痰、粪便或血液培养，整个检验流程需要在两周以上，现在采用基因诊断的方法，不仅敏感性大大提高，而且在1小时内就能得出结果。疾病的预防，就是检测健康人群的基因型，预测个人患病的风险，并向受检者提出生活上的指导，避免疾病的发生。比如结肠癌，APC基因、DCC基因和P53基因的缺陷与肠癌的发生有密切的关系。这几个基因存在缺陷的人具有患上结肠癌的高风险。通过基因检测，在上皮细胞的增生还没有真正演化成结肠癌的时候，就能够发现结肠癌的苗头，及早采取措施进行预防，就有可能防止结肠癌的产生。临床上研究发现基因UGT1A1启动子区域的多态性与药物伊立替康的毒副作用有相关性。如果盲目用药可造成中性粒细胞减少及腹泻的副作用。美国FDA已建议病人在使用伊立替康前要进行UGT1A1基因型的检测。中国国家卫生部在新的临床检验项目目录中也增列了“化学药品个体化用药基因检测项目”。UGT1A1基因型检测对于临床正确用药，减少毒副作用，提高疗效具有明确的临床意义。

因此，从临床角度而言，本领域中迫切需要开发出更为简便、灵敏且快速的基因检测方法以及适用于该方法的引物和试剂盒。

B.基因突变检测的临床意义

随着现代分子生物学研究的不断深入，对疾病发病机制、诊断及防治的研究已达到分子水平，从基因水平诊断和防治疾病已成为现代医学的重要课题。

突变基因改变了原有的结构与功能，导致原有的遗传性状发生改变，其中一部分基因突变可导致遗传病或具有遗传倾向的病甚至肿瘤。如血友病是凝血因子基因的突变、地中海贫血是珠蛋白的基因突变等。具有遗传倾向的高血压病、糖尿病、溃疡病等系多基因变异与环境因素共同作用的结果。肿瘤是体细胞基因突变的结果。

基因诊断(gene diagnosis)就是利用现代分子生物学和分子遗传学的技术方法，直接检测基因结构及其表达水平是否正常，从而对疾病作出诊断的方法。基因诊断的检测目的物是DNA或RNA，前者反映基因的存在状态，后者反映基因的表达状态。传统的诊断方法主要以疾病的表型改变为依据，生物个体的表型性状是基因在一定条件下的体现，基因的改变可导致各种表型的改变而出现疾病。近年来随着分子生物学技术的飞速发展，使开展基因诊断成为可能。

因此，基因突变的检测对于基因突变相关疾病的发病机理研究、诊断、易感性评估、患者用药选择、和/或预后评估具有非常重要的意义。

以表皮生长因子受体(Epidermal Growth Factor Receptor，EGFR)和KRAS基因为例。目前，EGFR与KRAS基因靶向治疗已成为晚期非小细胞肺癌(Non-small cell lung cancer，NSCLC)酪氨酸激酶抑制剂(tyrosine kinase inhibitor，TKI)易瑞沙和特罗凯药物治疗的研究的热点。研究表明，易瑞沙和特罗凯治疗效果显著的患者中EGFR基因突变的发生率明显高于治疗无效者。在有EGFR基因突变的患者中易瑞沙和特罗凯的肿瘤客观缓解率明显高于无突变的患者。EGFR基因突变率为33％，且突变部位90％左右位于编码酪氨酸激酶区的外显子19及外显子21(如L858R)，为杂合突变。EGFR的突变表达对选择酪氨酸激酶抑制剂治疗有着重要的指导意义，目前用于检测EGFR基因突变的标本多为手术切除的肿瘤组织标本，但晚期病人很难获得肿瘤组织，寻找一种易获得的肿瘤组织替代标本进行EGFR基因突变的检测，从中筛选出适合酪氨酸激酶抑制剂治疗的患者，实现个体化治疗，对临床工作非常重要。