[发明专利]一步法检测新型甲型H1N1 2009流感病毒的试剂制备方法和应用

权利要求书

1.一种用于检测pH1N1-2009流感病毒的一步法荧光RT-PCR检测试剂盒，包括溶液A，该溶液A包括一对特异性引物及一条荧光探针，所述特异性引物和荧光探针的序列为：

特异性引物：F：5’-CAACACCAACTT TGC TGC-3’

R：5’-GGAACCGATTCT TCACTG TTGTC-3’

荧光探针：probe：5’-F-CAGTCAGTGGTTCCGTGGAAATTAGC-Q-3’，其中F为荧光报告基团，Q为淬灭基团。

2.根据权利要求1所述的一步法荧光RT-PCR检测试剂盒，其特征在于：该荧光探针5’端标记的荧光报告基团F为6-羧基荧光素FAM，3’端标记的淬灭基团Q为特丁基对苯二酚BHQ。

3.根据权利要求2所述的一步法荧光RT-PCR检测试剂盒，其特征在于：所述溶液A还包括AgPath-ID^TM One-Step RT-PCR Kit试剂盒中的2×RT-PCR混合液。

4.根据权利要求3所述的一步法荧光RT-PCR检测试剂盒，其特征在于：还包括溶液B，该溶液B为Taq DNA聚合酶和AMV反转录酶。

5.根据权利要求4所述的一步法荧光RT-PCR检测试剂盒，其特征在于：还包括溶液C，该溶液C为DEPC-H₂O。

6.根据权利要求5所述的一步法荧光RT-PCR检测试剂盒，其特征在于：还包括阳性对照，该阳性对照为流感裂解疫苗稀释液。

7.根据权利要求6所述的一步法荧光RT-PCR检测试剂盒，其特征在于：还包括阴性对照，该阴性对照为SPF鸡胚尿囊液。

8.一种利用权利要求1所述的一步法荧光RT-PCR检测试剂的检测方法，其特征在于：实验步骤为：

(1)提取待测样本RNA；

(2)一步法将试剂盒中各组份混合配置成反应体系进行RT-PCR反应；

(3)直接读取检测结果，以刚好超过正常阴性对照扩增曲线的最高点为准设定阈值线；CT值大于38.0或无扩增曲线，判断为阴性；代表FAM的扩增曲线CT值小于或等于35.0，且出现典型的扩增曲线，判断为阳性。

9.根据权利要求10所述的检测方法，其特征在于：该待测样本RNA的提取采用《实用分子生物学方法手册》中的酚/氯仿核酸抽提法或采用市售RNA提取试剂盒，按试剂盒说明书操作。

10.根据权利要求10所述的检测方法，其特征在于：每次检测均设阴性对照组、阳性对照组和样品检测组，各组反应体系总体积均为25μl，各组份配比如下所示：

阳性对照组：14μl溶液A、1μl溶液B、5μl溶液C、5μl阳性对照RNA；

阴性对照组：14μl溶液A、1μl溶液B、5μl溶液C、5μl阴性对照RNA；

样品检测组：14μl溶液A、1μl溶液B、5μl溶液C、5μl待测样品RNA。

11.根据权利要求11所述的检测方法，其特征在于：该PCR反应的条件如下：50℃下反应30min进行逆转录；95℃下反应10min进行预变性；然后进行循环反应，每一轮循环反应包括95℃反应15s变性和55℃反应45s退火，循环数为45。

12.根据权利要求1所述的一步法荧光RT-PCR检测试剂盒在检测pH1N1-2009流感病毒中的应用。