[发明专利]一种用于快速检测马铃薯Y病毒的试剂盒及检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及病毒检测领域，具体涉及马铃薯Y病毒(Potato virus Y，简称PVY)的快速高灵敏检测试剂盒及其检测方法。

背景技术

马铃薯Y病毒的基因组是单一RNA正链，其粒体为微弯曲线状，大约长680～900nm，宽11～12nm。从1953年起马铃薯Y病毒在欧洲尤其在马铃薯广泛种植的地区流行，20世纪70年代在美洲扩展，中国东北烟区、黄淮地区和西南烟区等都有发生。如果在烟草移栽4周内感染马铃薯Y病毒脉坏死株系，可导致绝产绝收，即使在临近收获期感染该病毒病，也会导致25～45％的损失，此外更为严重的是烟草病叶烤晒后色泽和烟味较差，其品质大为降低。所以开发新的技术快速、准确、灵敏地检测PVY，加强烟草育苗和田间环境的监测，以预防病毒感染，切断病毒传播，保障我国烟草行业健康持续发展就显得尤为迫切和重要。

目前用于烟草病毒检测的方法主要有生物学诊断、电子显微镜、酶联免疫吸附技术(ELISA)以及分子生物学等方法：生物学方法主要是鉴别寄主反应或指示植物等，这种仅仅以鉴别寄主反应或指示植物为依据的方法，虽曾广泛运用，却由于其检测速度慢、受环境和季节影响较大等诸多因素限制而运用较少。电子显微镜技术虽然可以直接观察到病毒粒子的存在，但其操作复杂、耗费时间长；酶联免疫吸附技术(ELISA)虽具简便、快速等优点，但灵敏度较差，且存在非特异性反应，在PVY尚未引发感染或感染的极早期很难用抗体法检测出来；上述三种方法均不能快速、简便、准确地检测烟草普通花叶病毒。近年来发展起来的以分子生物学技术为基础的病毒检测方法主要有RT-PCR法以及PCR微量板杂交等检测方法，克服了上述三种方法的缺点，在实验室条件下实现了烟草普通花叶病毒的相对快速、准确检测。由于常规的PCR检测需要昂贵的PCR仪，凝胶电泳和成像系统，使得RT-PCR检测法难以用于现场的快速检测，这大大限制了RT-PCR检测方法在生产中的推广应用。

进行马铃薯Y病毒早期检测并采取预防措施是烟草生产中降低烟草花叶病毒流行风险、减少发病照成巨额经济损失的有效手段，所以建立简单、快速、高灵敏的检查方法，并开发适于现场应用的马铃薯Y病毒检测试剂盒就显得极为重要。

发明内容

本发明的目的是提供一种适于生产现场应用、快速、高灵敏度且易操作的马铃薯Y病毒检测方法，并将检测方法标准化，同时将检测试剂集中于规范的试剂盒中，以克服现有技术的不足，使PVY的检测更准确、灵敏、快速、安全和方便。

首先，本发明针对PVY的衣壳蛋白基因中保守区段设计4条特异引物，利用反转录酶和DNA聚合酶，无需单独对目的核酸(RNA)进行反转录，在恒定温度下保温一段时间即可同步完成对目的核酸的反转录和扩增，实现对PVY的快速和高灵敏检测。

为了进一步缩短检测时间、消除检测过程中可能发生的污染、简化检测步骤，使检测实验能够在田间开展，本发明对PVY的检测方法进行了优化。现在技术中，在用FTA卡(英国Whatman公司)制备样品核酸的标准步骤中，需要将被样品匀浆液润湿的FTA膜片在室温下干燥至少一个小时，然后才能进行漂洗；本发明通过在被样品匀浆液润湿的FTA膜片上滴加亲水性且易挥发的醇类物质(主要是叔醇、伯醇和仲醇，例如甲醇、乙醇、异丙醇等)，使润湿的FTA膜片在室温条件下仅需几分钟即可完成干燥过程，大大缩短了样品核酸制备的时间。

在利用等温扩增方法检测病原时，目前普遍采用扩增反应结束后向反应管中添加核酸染料以判断检测结果。由于等温扩增反应的产物量非常大，这种打开反应管再添加核酸染料的方法极易导致后续待检样品被污染而使检测结果出现假阳性；已有报道和已公开专利采用在扩增反应试剂中添加尿嘧啶DNA糖基化酶(UNG酶)的方法消除污染风险，但却增加了成本。本发明通过在用于扩增反应的小管内预置染料的方法，可有效消除污染风险，又不增加成本。本发明采用两种方法解决上述问题，其一是将金属离子与钙黄绿素形成的配合物(即染料)与扩增反应液预先混合，置于扩增反应小管内；其二是先将核酸染料粘附到扩增反应管的内侧上方或盖子内侧，等扩增反应结束后再通过上下反复震荡使扩增反应液和核酸染料混合；这样反应结束后无须打开扩增反应管就能完成扩增产物的染色，消除了打开扩增反应管再添加核酸染料过程中反应液可能溅出造成后续待检样品被污染的风险。

现在技术中，在用FTA卡制备样品核酸的标准步骤中，需要用Whatman公司(英国)专门的纯化试剂反复漂洗FTA膜片。本发明无需专门的纯化试剂，采用普通的蒸馏水漂洗即可完成FTA膜片的纯化，不仅简化了检测的操作步骤，还降低了实验成本。