[发明专利]电化学检测可卡因的方法及其中使用的三段式适配体探针

说明书

技术领域

本发明涉及生物检测领域，具体涉及可卡因检测的领域，更具体地涉及利用适配体探针进行可卡因电化学检测的领域。

背景技术

目前对于毒品的检测技术虽有很多，如高效液相-紫外光谱技术、质谱技术、高效液相-电化学技术、电子鼻、电子俘获、显微拉曼技术(MRS，micro raman spectroscopy)、X射线探测技术、热中子断层扫描等。这些技术的检测灵敏度高，但检测步骤繁琐、设备昂贵，测试程序复杂，成本较高，需要专业技术人才，不适合现场快速筛查使用。

针对缉毒工作的实际需求，需要开发灵敏度高、选择性好、便携式、能耗低、易操作的智能化毒品快速检测产品，以达到现场、灵敏、快速的检测目的。目前国内外正对吸毒人员快速现场筛查和液体中毒品检测的主要技术是各种基于免疫反应的产品，主要有酶免疫分析和免疫胶体金技术。前者涉及酶反应，检测步骤繁琐，试剂稳定性差，通常不能很稳保存。后者简便，快速，但误判率高，只能进行定性测试，灵敏度较低，难以进行质量控制，即使是同一批生产的试剂，也很难保证每个试剂的同一性，因此一般只能用于定性试验，不能进行定量分析。

相对于抗体，适配体具有多方面的显著优点。适配体(aptamer)是新一代的非常有应用前景的功能性生物分子。适配体是从～1014的随机序列的DNA或RNA库中通过指数富集的系统分子进化方法(SystematicEvolution of Ligands by EXponential enrichment，简称SELEX)筛选出来的，能够特异性地与靶标分子结合，从而特异性地识别靶标分子(Ellington AD，Szostak JW(1990)Nature 346：818-822.Tuerk C，Gold L(1990)Science249：505-510.)。适配体可以用于包括蛋白质、小分子、重金属离子、细胞和病毒等的各种各样的生物分子的检测，具有极大的应用前景。与传统的抗体相比，适配体在多个方面具有显著的优越性(表1)。适配体稳定性高、价格低廉、不同批次产品质量完全相同，而且具有与抗体相当甚至更好的专一性和亲和性。

表1：适配体与抗体的比较

目前利用适配体进行可卡因检测的方法，主要是使用一段适配体(M.N.Stojanovic，et.al，J.Am.Chem.Soc.2001，123，4928-4931.；B.R.Baker，et.al，J.Am.Chem.Soc.2006，128，3138-3139)，或使用将一段分开成两段的适配体进行可卡因的检测(Stojanovic，M.N.；de Prada，P.；Landry，D.W.J.Am.Chem.Soc.2000，122，11547-11548.；J.Zhang，et.al，small 2008，4，No.8，1196-1200；R.Freeman，et.al，J.Am.Chem.Soc.2009，131，5028-5029；Analyst，2009，134，653-656；X.Zhou，et.al.，J.Am.Chem.Soc.2009，131，6944-6945)。在具体的检测方法上主要是利用荧光淬灭、酶催化的颜色反应、电化学或纳米金颜色反应进行可卡因的检测。这些方法的检测灵敏度在0.1μM-500μM的范围内。

具体到可卡因的电化学检测方法，一种是使用一段适配体的方法(B.R.Baker，et.al，J.Am.Chem.Soc.2006，128，3138-3139)。在该方法中，适配体的一端修饰有用于在金电极上组装的巯基，另一端上修饰有氧化还原基团亚甲基蓝(Methylene blue)。可卡因可以引起可卡因适配体的构相变化，从而使可卡因适配体的修饰有氧化还原基团亚甲基蓝的一端接近电极表面，从而引起电极表面电流的增加，实现可卡因的定量检测，该方法的检测灵敏度为10μM。第二种是使用两段式适配体探针(J.Am.Chem.Soc.，Vol.131，No.21，2009，6944-6945.)，将一段探针通过巯基组装到电极上，而将另一段标记氧化还原基团亚甲基蓝。在可卡因存在的时候，氧化还原基团亚甲基蓝修饰的探针通过与可卡因在电极表面上的探针形成络合物而被带到了电极表面，从而引起电极表面电流的增加，将检测的灵敏度提高了一个数量级(1μM)。