[发明专利]一种香石竹四种病毒的同步检测方法

说明书

技术领域

本发明属于植物病毒检测领域，具体涉及一种香石竹四种病毒的 同步检测方法。

背景技术

在香石竹病毒的RT-PCR检测技术中，孔宝华等人(孔宝华，蔡 红等.香石竹斑驳病毒的鉴定和PT-PCR检测[J].植物保护，2002，2，28 (1)：5-8)根据香石竹斑驳病毒CarMV的RNA序列设计引物，可从 RNA稀释10⁴的RNA粗提液中检出香石竹斑驳的病毒。赵珊等人(赵 珊，王继华，王丽花，杨秀梅.香石竹坏死斑点病毒的鉴定与检测[J].西 南农业学报，2010，1：103-106)通过设计引物能从香石竹坏 死斑点病毒CNFV感病香石竹组织中检测出CNFV病毒，灵敏性测定 结果表明该特异性引物RT-PCR可从稀释10⁶植物总RNA中检测出 病毒。

经过多年不断的完善，目前PCR技术已经发展成为一种通用技 术，多重RT-PCR可以在一个反应中同时提供常规法数次反应的扩增 信息，这种高效快速的优势使其在植物病毒检测与无病毒苗快速繁育 推广中具有重要意义，但利用该技术同时检测多种香石竹病毒中尚未 见报道。

香石竹病毒病是香石竹上的一类重要病害，引起香石竹病毒病的 病毒种类很多，国内外已报道有10余种，但一般认为，香石竹斑驳 病毒(Carnation mottle virus，CarMV)、潜隐病毒(Carnation latent virus，CLV)、环斑病毒(Carnation ring spot virus，CRSV)和坏死斑 点病毒(Carnation necrotic fleck virus，CNFV)是世界上对香石竹生产 危害最大的4种病毒。

发明内容

为了解决上述问题，本发明的目的在于提供用于香石竹四种病毒 的同步检测的引物、检测方法及其检测试剂盒。

本发明的一个目的在于提供用于香石竹四种病毒同步检测引物， 包括：

CarMV上游引物：ACGCTCACCTCGCCAATTTGCTT

CarMV下游引物：TCCGCAGTCCGCACATTCCTACT；

CRSV上游引物：AATCCAAAATGGCGCTGGTGCCT

CRSV下游引物：CATCAGTGAAACGCGACCGCTCA；

CLV上游引物：TGTTGGGCTGTCGCACGTTACTG

CLV下游引物：GGTGGGGATTTGGCGAACAGCAT；

CNFV上游引物：TGGAGTGCGTCACCTTGAGTGGT

CNFV下游引物：GTCGAAAGTGCCGCCTCCGAAAT。

本发明的另一个目的在于提供香石竹四种病毒同步检测方法，包 括如下步骤：

1)提取香石竹的总RNA；

2)RT-MPCR：将步骤1)中得到的RNA反转录后，用权利要求 1所述的引物扩增反转录产物，并进行电泳检测。

本发明还提供香石竹总RNA的提取方法，步骤如下：

1)称取0.05～0.1g香石竹幼叶或花瓣至研钵中，在液氮下研成 极细粉末，将粉末迅速转移至预冷的1.5mL离心管中，加0.8～1.2mL Trizol后用漩涡混合器充分混匀，于室温下静置5min，使其充分裂解；

2)13000rpm，4℃离心10～15min，吸上清，加等体积的体积比 为24∶1的氯仿∶异戊醇，漩涡混合器充分混匀，静置2～3min；

3)12000rpm，4℃离心10～15min，吸上清至新的离心管，加0.7 倍体积的异丙醇，漩涡混合器充分混匀，-70℃静置10～30min；

4)12000rpm，4℃离心10～15min，弃上清，加300～500μL 75％ 乙醇进行洗涤，温和振荡离心管，悬浮沉淀，7500rpm，4℃离心5～10 min，弃上清；

5)300～500μL 75％乙醇重复洗涤一次，室温晾干或真空干燥5～10 min，用50～100μL无RNase的双蒸水溶解RNA样品，于-70℃保存 备用。

根据本发明，扩增香石竹反转录产物的PCR反应体系为：