[发明专利]一种次氯酸的新型绿色荧光变体蛋白探针及其编码序列

说明书

技术领域

本发明涉及生物化学、蛋白质化学、分子生物学。具体地，本发明涉及一种可高灵敏度地检测细胞内次氯酸水平的新型绿色荧光突变蛋白及其编码核苷酸序列。本发明还涉及该突变蛋白及其核苷酸序列的制备方法和用途。

背景技术

传统的次氯酸(HOCI)探针为有机化学荧光探针，这类探针虽然灵敏度很高，特异性好，但存在可溶性差、易发生荧光淬灭、有细胞毒性等缺点，不能用于活菌及活细胞检测，不能用于定位检测细胞内不同细胞器中的次氯酸水平，而且有环境污染问题。

绿色荧光蛋白(Green Fluorescent Protein，简称GFP)是从水母分离出的一种天然绿色荧光蛋白，分子量约27KDa，由239个氨基酸残基组成的单链多肽。GFP的生色基团由位于第65-67位的3个氨基酸：丝氨酸一脱水酪氨酸一甘氨酸形成的对羟基苯咪唑啉酮(4-p-hydroxybene-5-imidazo-linone)构成。其主要荧光激发波长为395nm，激发GFP产生的发射波长主要为508nm荧光。野生型GFP分子的支架包含多条折叠的β片层，由多个小环将这些片层相连。天然GFP折叠不稳定在大肠杆菌中表达常可产生错误折叠，溶解性差，而且与目的蛋白融合后常变为不溶性，荧光弱，提取复性时对化学处理和温度导致的变性耐受差，因而难以广泛应用。一些学者对野生型GFP进行了分子基因工程学改造，主要是引入增强折叠的定点突变和随机突变，从中筛选得到了折叠更强、荧光更亮，溶解性更好的GFP变体蛋白。例如，第65位的丝氨酸突变为苏氨酸后(S65T)，此GFP变体的最大激发光为485nm，荧光发射光为528nm，蛋白自身折叠较快而稳定，荧光强度提高了5倍。另外，也制备了增强型GFP(enGFP)[Crameri等；Nat.Biotechnol.14；315-319，1996]，折叠型报导蛋白GFP[Waldo等；NatBiotechnol.17：691-695，1999]和环重排和/或受体插入的绿色荧光蛋白变体[Topell.S等；Methodr Mol Biol.183：31-48，2002和Topell.S等；FFBS Lett.457：283-289，1999及、Baird.G.S等；Proc Natl Acad Sci USA.96：11241-11246，1999]。这些变体与GFP相比，折叠强度和稳定性、荧光强度和溶解性，对化学试剂和温度导致的变性耐受力等有所改善。特别是近年制备的新型超折叠绿色荧光蛋白(Superfolder green fluorescent protein，简写为SFGFP)[Pedelacq J-D等；Nature biotechnolegy.24(1)：79-88，2006]性能优异，折叠强度和稳定性、荧光强度和溶解性，对化学试剂和温度导致的变性耐受力大大提高，复性时重折叠快而活性好，不论与其融合的伴侣蛋白是否错误折叠或不溶都不影响SFGFP的这些性能。

GFP及其改进变体作为不需要酶底物或辅因子的可检测报导分子，已广泛用于各类细胞和生物的基因表达和蛋白靶向各种研究中[Tsien.R.Y等.，Annu Rev Biochem.67：509-549，1998]，例如，与目的蛋白融合(或称为加入绿荧光蛋白尾)作为探针在细胞内表达，可用荧光显微镜直接观察，追踪目的蛋白在细胞内的分布部位和动态变化。此外，可将一些具有生物学、化学、电学和物理学性能的传感肽(如钙调蛋白肽)插入到GFP中，形成的构建物可用于检测这种传感肽对体内外环境刺激的反应(如氧还电势，细胞内离子浓度等)[Roger.Y.Tsien和Geoffrey Baird的美国专利US7,060,793]。