[发明专利]一种仿刺参AjE101微卫星DNA标记的检测方法

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学DNA标记技术与应用领域，具体涉及海洋经济种仿刺参(Apostichopus japonicus) 的EST (Express Sequence Tag，表达序列标签) 微卫星标记筛选开发和应用。

背景技术

仿刺参为刺参科仿刺参属的动物，俗名刺参。分布于北太平洋区、包括俄罗斯、日本、朝鲜半岛沿岸以及中国，常见于波流静稳、海草繁茂和无淡水注入的港湾内底质为岩礁或硬底。仿刺参是食用海参中品质最好，分布最广，产量最大的一种。在我国，仿刺参养殖业主要分布于辽宁、河北、山东、江苏等地等沿海地区。目前,仿刺参的研究大多是关于仿刺参常规育种、增养殖等领域,关于分子标记方面的研究比较少。开发遗传标记并用于遗传图谱构建、品种鉴定、遗传多样性等方面的研究无疑是解决仿刺参养殖过程中出现问题的一个有效途径之一。

随着仿刺参在分子生物学领域的研究工作不断深入，对仿刺参分子标记的需求也越来越多。遗传改良或品种培育是仿刺参养殖稳定发展的动力，许多研究表明，遗传变异水平与生物的生长速度、抗病能力等生产性状密切相关，因此，开发仿刺参的分子遗传标记，检测仿刺参遗传多样性、研究其遗传结构，进而实施分子标记辅助选育，对于仿刺参的育种和增养殖都具有十分重要的意义。

EST是指通过从cDNA文库中随机挑取的克隆, 进行大规模测序所获得的cDNA的5’或3’端序列，长度一般为150-500 bp。近年来大量快速增长的EST数据已成为SSR的重要来源，约有1％- 5％的EST含有SSR。与gSSR（基因组微卫星）标记相比，从EST序列中中获得EST-SSR标记更经济，更有特点；由于EST是功能基因的表达片段，在其中发现的微卫星标记会直接和功能基因相关，并有可能和一些生产性状相关联，这些特点对遗传图谱构建以及标记辅助选育都有很高的应用价值；同时，由于不同物种间基因共显性和保守性，从一种物种中开发的EST-SSR可能同时用于近缘的其他物种研究，从而为比较基因组学、同源基因克隆提供新的途径。因此，EST-SSR已被用于构建遗传图谱、分离与鉴定新基因、基因表达差异研究、比较基因组研究和制备DNA芯片等方面。利用EST微卫星标记，可能把仿刺参重要经济性状与之关联起来，达到分子标记辅助育种的目的，并可进一步进行仿刺参功能基因的研究。目前关于仿刺参EST微卫星标记的研究还很少。

发明内容

本发明的目的是为了简便快速的鉴定仿刺参AjE101遗传标记基因座位的遗传变异图谱，丰富现有的仿刺参微卫星标记，寻找更多的多态性好、稳定性高的微卫星标记，提供了一种仿刺参AjE101微卫星DNA标记的检测方法。

本发明是通过以下方案实现的：

一种仿刺参AjE101微卫星特异性DNA引物，其特征在于其核苷酸序列分别如SEQ ID NO：1和 SEQ ID NO：2所示。

一种利用仿刺参AjE101微卫星特异性DNA引物的PCR反应体系，其特征在于所述的PCR体系为：10×PCR缓冲液：2.0μl；10mM的SEQ ID NO：1和 SEQ ID NO：2引物对各：0.2-0.5μl；10mM dNTP：0.4-5μl；ddH₂O：14.6-15.9μl；5U/μl Taq酶：0.2-0.3μl；10ng仿刺参DNA：1-1.5μl。

一种仿刺参AjE101微卫星DNA标记的检测方法，其特征在于包括以下步骤：先提取仿刺参基因组并稀释备用，再利用仿刺参AjE101微卫星DNA核心序列（AT）n 其中n=22-24，在其序列两端设计特异性引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1-2所示；然后使用该引物对仿刺参不同群体或者群体内个体的基因组DNA进行PCR扩增，对PCR产物进行变性聚丙烯酰胺凝胶检测。利用产物出现的条带银染显色后进行分析，确定每个个体的基因型，从而获得仿刺参在AjE101遗传标记基因座位的多态性遗传变异图谱（如图1所示）。

AjE101微卫星DNA序列的特异性引物核苷酸序列分别为：正链SEQ ID NO：1：5’-TAGCCGTTTCATCCTTCA-3’，负链SEQ ID NO：2： 5’-ATGACAAGAAACGGGAGA-3’，退火温度为49-55℃。