[发明专利]基于fimY基因的沙门氏菌检测试剂盒及其检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物检测试剂盒及方法，特别涉及基于fimY基因的沙门氏菌检测试剂盒及其检测方法。

背景技术

沙门氏菌( Salmonella) 是肠杆菌科中常见的人兽共患病原菌,不仅能导致鸡白痢、仔猪副伤寒、流产等动物疾病,还能使人类发生伤寒、副伤寒、败血症、胃肠炎和食物中毒,在世界各地的食物中毒中,沙门氏菌引起的中毒病例位列前位。目前沙门氏菌的快速检测方法主要有免疫酶试验、免疫扩散法、乳胶凝集试验、聚合酶链反应和免疫荧光法及酶联免疫吸附试验( ELISA) 等方法 ,但在操作程序、检测时间、特异性检测等方面尚不理想。

环介导等温扩增(loop mediated isothermal amplification ,LAMP) 是一种新型的核酸检测方法,其特点是针对靶基因的6 个区域设计2 对特异引物,利用链置换DNA 聚合酶在恒温条件下作用40～60 min ,即可完成检测,结果判断直观,通过扩增副产物焦磷酸镁沉淀的浊度即可判断是否发生反应。LAMP 方法具有操作简便、检测快速、灵敏度高、成本低廉且易推广等优点,在疾病诊断、病原检测等领域得到了广泛应用。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种基于fimY基因的沙门氏菌检测试剂盒，其灵敏度高，特异性好，操作简单快速，准确可靠，检测成本低。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

基于fimY基因的沙门氏菌检测试剂盒，含有以下特异性引物：

上游外引物F3：5’-cgaagaaagctttgcctgtg-3’;

下游外引物B3: 5’- cagtacgcgaagccttgtt-3’；

上游内引物FIP:5’-gcacgtcagcaaagcgtacctt-gggaaggttaaggagggtga-3’;

下游内引物BIP:5’-agaggcgccttgcgctaaag-ccaaacctcgcttatcggaa-3’;

进一步，所述的基于fimY基因的沙门氏菌检测试剂盒，还包括

上游环引物LF:5’- cgtgtagtttaccggcttaaacaa-3’；

下游环引物LB: 5’-caatcatcaaccagtcagtacggc-3’；

进一步，所述的基于fimY基因的沙门氏菌检测试剂盒，所述试剂盒有24μL反应体系的试剂，所述24μL反应体系的试剂包括：浓度各为0.2 μmol/L的上游外引物F3和下游外引物B3,浓度各为0.8μmol/L的上游内引物FIP和下游内引物BIP, 浓度各为0.4μmol/L的上游环引物LF和下游环引物LB，浓度为1.0 mmol/L三磷酸脱氧核糖核苷酸混合液, 浓度为1mol/L的甜菜碱, PH值为8.8、浓度为25mmol/L 三羟甲基氨基甲烷盐酸盐 , 浓度为10 mmol/L 氯化钾, 浓度为10 mmol/L 硫酸铵, 浓度为5 mmol/L 硫酸镁, 质量百分数为0.1%的聚乙二醇辛基苯基醚, 8 单位Bst DNA 聚合片段酶, 余量为无RNA酶超纯水。

本发明的另目的在于提供一种沙门氏菌检测方法，该方法操作简单，适用于大规模应用。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

4、1～3任一项所述基于fimY基因的沙门氏菌检测试剂盒的检测方法，具体由以下步骤组成：

A、提取待测样品的DNA作为模板DNA，控制模版DNA水溶液的OD₂₆₀/OD₂₈₀在1.6～2.0范围内，浓度在10～100ng/μl范围内；

B、在24μL反应体系的试剂中加入1μl待测模版DNA水溶液，并在      60～65°C条件下保温60分钟，80°C保温5分钟终止反应液；

C、反应终止后，加入质量分数为10%的荧光染料赛博绿Ⅰ水溶液1μl,用肉眼观察颜色变化，如果颜色为橘黄色，说明待检样品不含沙门氏菌；如果颜色变为绿色，则说明样品中含有沙门氏菌。