[发明专利]可重复使用的智能生物催化剂(包括固定化酶和应激载体)及其在有机合成中的应用

说明书

技术领域

本发明试剂使用载体将酶进行固定化后得到的智能催化剂的制备及其在重要化学品合成中的应用。 

背景技术

随着对环境保护的日益关注，在合成化学品时，发展对环境友好的合成方法是非常迫切的。在此需求下，酶作为催化剂，由于其温和的反应条件，优异的立体、区域、化学选择性，使其成为合成重要的工业化学品时非常有效的方法。采用生物催化过程，能够从根本上优化精细化学品如：医药、农药、香料和香水、食品添加剂及护理产品的合成路线。在酶的应用过程中，人们也注意到酶的某些不足，如：酶的催化活性不高、酶的稳定性较差、不能重复使用、不易于分离纯化。针对酶的上述不足，利用生物分子工程技术，可以有效的改善酶的pH稳定性、热稳定性、催化活性等方面；利用酶固定化技术，可以有效的克服酶在使用中不易重复使用及分离的缺点，有效的降低了生产成本。固定化酶既保持了酶的催化活性，克服了游离酶的不足，非常容易的从体系中分离出来，对于连续生产而言，是非常有益的，某些实验结果表明通过固定化，可以提高酶的催化效率、增加稳定性等。目前的方法，是将酶固定在不溶于水的载体上，反应在非均相体系中进行。非均相反应体系中存在某些不足的，如：由于酶与载体的结合时可能会影响酶的空间构象而降低酶的催化活性；由于酶与反应底物在非均相的体系中，不可避免的会使酶与底物之间的相互作用速度降低，从而影响了反应的速率及生产效率。 

发明内容

针对上述现有酶固定化的不足，本发明介绍了将具有催化功能的酶与基于聚N-异丙基-丙烯酰胺(PNIPAAm)聚合物及其它具有应激功能的聚合物作用得到智能生物催化剂，随后将其应用于精细化学品合成的方法。 

在本发明中，酶催化剂固定在应激载体上。这些载体材料，在不同的外界刺激下，可逆的实现在水中或是其他溶剂中的溶解与析出。载体固定化生物催化剂与载体在水中及其他溶剂中表现出了一致的溶解-析出的现象。当固定化催化剂在均相体系中完成反应后，可以通过适当改变反应体系的PH值、温度、离子强度或者是加入某化学物质，使得固定化催化剂从体系中以沉淀形式析出，而产物则在溶液中，从而实现了产物与催化剂的分离。 回收的酶可以重新溶解在缓冲溶液中进行循环使用，实现了酶的回收再利用。使用上述的技术方法，可以有效结合均相催化与非均相催化的优点，有效地避免了各自的缺点，是一种极有应用价值的新方法。 

众多的天然产物或是人工合成的聚合物，在温度、PH值、离子强度改变时，其构象也会发生相应的改变，这些高分子聚合物作为智能材料在生物、医药方面都有广泛的应用，既应用于药物传递系统、细胞粘附介质中，又可以应用在控制酶的功能及基因表达方面。在这些众多的智能材料中，聚N-异丙基-丙烯酰胺(PNIPAAm)是一种在水相中热可逆的溶解-析出的聚合物，其临界共溶温度较低为32℃。当加热的温度超过32℃时，该聚合物就会从水相中析出形成沉淀，当温度低于32℃时，沉淀会重新溶解在水相中，并且这种析出-溶解的过程是完全彻底的。 

通过改变与N-异丙基-丙烯酰胺共聚物的种类可以调整这种聚合物的临界共溶温度。例如：在四氢呋喃-甲苯的混合溶剂中以摩尔比40∶1加入N-异丙基-丙烯酰胺与N-丙烯酰氧基-琥珀酸酰亚胺，加入偶氮二异丁腈(AIBN)诱发聚合反应。反应完毕后，加入正己烷使聚合物析出，真空干燥。得到的聚合物的临界共溶温度约为33℃，其结构中含有一个活化的酯基基团，该酯基基团的反应活性远远高于蛋白质分子中的一级胺。 

具体实施方式

以下通过具体的实施例来进一步说明，但是这些实施例不构成对本发明的限制。 

实施例：1羰基还原酶的固定化 

在磷酸缓冲溶液(100mM，pH 8.0)中，将来源于Sporobolomyces salmonicolor(SSCR)的羰基还原酶与聚合物室温下作用2小时，加入NaCl溶液后，白色沉淀析出，得到的沉淀用相同浓度的NaCl溶液洗涤。如果不加入NaCl溶液，将反应溶液加热至高于33℃(LCST)时，同样有白色沉淀析出。 

分离出来的固定化酶以及在反应溶液中的酶的蛋白浓度及反应活性均进行了测定。蛋白质的结合产率是指被固定化蛋白质与初始加入的蛋白质的数量比。酶的结合产率是指被固定化酶的反应活性与初始加入的蛋白质反应活性比。相对反应活性是固定化酶的反应活性与游离酶的反应活性比。实验表明蛋白质的结合产率为53％，固定化酶的相对反应活性为72％，酶的结合产率为38％。 

实施例：2D-葡萄糖脱氢酶(GDH)的固定化