[发明专利]一种HBV基因分型的PCR检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种HBV基因分型的PCR熔解曲线检测方法。

背景技术

乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus, HBV）主要通过宿主免疫机制引起肝脏损害，机体免疫系统识别病毒抗原并攻击受感染的肝细胞引起炎症，这个过程受包括宿主与病毒的多个因素影响。病毒基因异质性影响着抗原的表达，在此过程中也扮演着重要的角色。不同的毒株出现某些变异的频率不同，不同毒株对机体免疫清除抵抗力不同以及其它的因素均可能导致了不同基因型具有不同的感染后疾病谱。

通常将HBV分为A～H八种基因型，分型依据为全基因序列异质性≥8％,或S基因序列异质性≥4％。HBV基因型呈一定地理区域分布。我国北方以C型为主，南方以B型为主，D型多见于少数民族地区，如西藏、新疆，不同基因型致病性不同。有研究证明HBV的基因型不仅影响乙型肝炎患者病情进展，而且与抗病毒疗效和临床预后有一定的相关关系。因此，HBV基因分型研究对进一步明确乙型肝炎发病机制、寻找治疗对策、实现流行病学控制、以及对抗病毒治疗反应和病情预后评估均有重要意义。现在已经有一些HBV基因分型的方法，其中测序法提供的信息全面可靠，但该方法繁琐、费时、实验条件和要求高，不适宜广泛开展。而其他方法的结果均不如测序法可靠，目前仍然未被标准化和商业化，如PCR-RFLP操作繁琐，且酶切位点易受基因变异的影响影响结果判断；PCR微板核酸分子杂交-ELISA法操作技术简便，适用于一般实验室测定，但无法对血清HBsAg阴性的HBV感染进行基因分型；型特异性引物PCR操作相对简单、结果准确，但仍需进行两轮PCR，产物电泳的步骤，存在产物污染的可能。

发明内容

本发明的目的在于提供一种HBV基因分型的PCR检测方法，该方法能够简便、快速、准确地鉴定HBV基因型。

本发明的技术方案如下：

根据乙型肝炎病毒基因型的全基因组序列设计引物；在上述引物的存在下，在荧光PCR仪中，对从血清样品提取的DNA进行PCR扩增，利用熔解曲线分析PCR产物，根据PCR产物的Tm值来判断基因型，实现乙型肝炎病毒的基因分型。

其中所述乙型肝炎病毒基因型为乙型肝炎病毒基因型B，引物序列如下：

上游引物BF：AGTTAATCATTACTTCCAGACGC

下游引物BR：CTGTAGATCTTGTTCCCAAGAAT

所述乙型肝炎病毒基因型为乙型肝炎病毒基因型C，引物序列如下：

上游引物CF：TGTTCCGACTACTGCCTCAC

下游引物CR：GGACAAATTGGAGGACAAGAG。

上述引物的设计步骤为：根据文献（吴光华,丁惠国,曾长青.公共核算数据库乙肝病毒全基因组序列概况和中国HBV参照序列的建立.自然科学进展,2008,18:121-129.）报道的中国HBV B、C型的全基因组序列，按照引物的设计原则，利用Primer Premier 5.0软件自行设计B、C型特异性引物，之后到Pubmed数据库上进行blast，证实引物的目的扩增片段为HBV的基因序列；根据扩增片段的Tm值来判断基因型。

所述PCR扩增的条件为：采用50μL的反应体系，2倍浓缩的SYBR Premix Ex Taq 25μL，引物对10μM/L各1μL，50倍浓缩的ROX Reference Dye 1μL，HBV DNA模板4μL，dH₂O 16μL；于ABI7000荧光PCR仪进行反应并检测，PCR反应条件：95℃ 30s，然后按95℃ 5s，60℃ 31s，进行40个循环，荧光检测在60℃。荧光通道检测选择SYBR。