[发明专利]磺胺六甲氧嘧啶检测试剂盒、其制备方法及其应用

权利要求书

1.一种磺胺六甲氧嘧啶检测试剂盒，包括不透明微孔板、检测试剂，其特征在于，检测试剂由如下组份组成：磺胺六甲氧嘧啶系列标准液、辣根过氧化物酶HRP-磺胺六甲氧嘧啶SMM酶标抗原、HRP-SMM样品稀释液、化学发光底液A、化学发光底液B和洗涤液组成，分别独立盛装于试剂瓶中；化学发光底液A为2×10^-5～1×10^-3mol/L鲁米诺溶液、5×10^-5～1×10^-3mol/L对羟基苯酚溶液和pH8.0的0.1mol/L Tris－HCl的混合溶液；化学发光底液B为2×10^-5～1×10^-3mol/L过氧化氢溶液；所述不透明微孔板各孔包被有浓度为2                                                磺胺六甲氧嘧啶的包被抗体。

2.如权利要求1所述的磺胺六甲氧嘧啶检测试剂盒，其特征在于，所述磺胺六甲氧嘧啶系列标准液为：0.6pg/ml、1pg/ml、6pg/ml、60pg/ml、100pg/ml；所述HRP-SMM样品稀释液为0.05mol/L碳酸盐缓冲液；洗涤液为含有质量百分比0.05%吐温-20的pH7.2 0.01mol/L磷酸盐溶液。

3.如权利要求2所述的磺胺六甲氧嘧啶检测试剂盒，其特征在于，所述碳酸盐缓冲液为碳酸钠和碳酸氢钠混合液；磷酸盐溶液为磷酸氢二钠溶液和磷酸二氢钠溶液混合液。

4.制备权利要求1-3任何一种所述的磺胺六甲氧嘧啶检测试剂盒的方法，其特征在于，通过如下方法实现：

（1）HRP-SMM样品稀释液、洗涤液的配制

称取碳酸钠、碳酸氢钠，将两者混合，加纯水溶解，制成0.05mol/L碳酸盐缓冲液，过滤除菌，4℃保存作为HRP-SMM样品稀释液；称取吐温-20、取0.2mol/L Na₂HPO₄ 溶液，0.2mol/L NaH₂PO₄溶液和NaCl，加纯水溶解，制成含有质量百分比0.05%吐温-20的pH7.2 0.01mol/L磷酸盐溶液，过滤除菌，4℃保存作为洗涤液；

(2) 制备包被抗磺胺六甲嘧啶多克隆抗体的微孔板

不透明微孔板中加入磺胺六甲氧嘧啶的包被抗体，用pH9.6的碳酸盐缓冲液稀释，每孔加200于检测板孔内，使包被多克隆抗体的浓度为2，置4℃过夜；弃去包被液，用上述配制的洗涤液洗涤各孔，在吸水纸上拍干；随之每孔加入封闭液，随后弃去封闭液拍干，室温下干燥；干燥后的酶标板，迅速真空封口包装，将封装好的板存于2-8℃；

（3）、标准品的制备

将磺胺六甲嘧啶用pH9.0-9.5的磷酸盐溶液稀释成五个梯度浓度，分别是：0.6pg/ml、1pg/ml、6pg/ml、60pg/ml、100pg/ml，分装于瓶中；

（4）、化学发光底物的制备

将2×10^-5～1×10^-3mol/L鲁米诺溶液、5×10^-5～1×10^-3mol/L对羟基苯酚溶液和pH8.0的0.1mol/L Tris－HCl混合制得化学发光底液A；配制2×10^-5～1×10^-3mol/L过氧化氢溶液为化学发光底液B；

（5）HRP-SMM酶标抗原的制备

取磺胺六甲氧嘧啶溶于二氧六环中，此溶液为I液；取辣根过氧化物溶于pH7.2磷酸盐缓冲溶液中，此溶液为II液；置I液于磁力搅拌器上搅动，加入II液，然后加入戊二醛，避光搅拌反应生成偶联物，最后把偶联物装入透析袋中，在4℃下用pH7.2磷酸盐缓冲溶液透析即可。

5.如权利要求1-3任何一种所述的磺胺六甲氧嘧啶检测试剂盒的应用，其特征在于，通过如下步骤检测：

（1）平衡：从冷藏环境中取出样品及试剂，于18~25℃平衡30±5min；

（2）加样和酶标抗原：取微孔板，预设一个空白对照孔，空白对照孔加入50样品稀释液，其余每孔加入50待测样品；然后微孔板上所有孔均加上100HRP-SMM酶标抗原，振荡5分钟，37℃孵育1小时；

（3）洗板：甩去板孔中的液体，用洗涤液冲洗,在吸水纸上拍干；

（4）加发光底物：每孔先后加入化学发光底液A、化学发光底液B各50，避光振荡2分钟；

（5）测定：在化学发光仪上测出各孔相对发光值。