[发明专利]一种γ-氨基丁酸的生产方法及其生产菌株

说明书

技术领域

本发明涉及γ-氨基丁酸的生产方法及其生产菌株，属于基因工程技术领域。

背景技术

γ-氨基丁酸（γ-Aminobutyric acid，简称GABA），由谷氨酸（Glutamic acid，Glu）经谷氨酸脱羧酶（Glutamate decarboxylase, 简称GAD）催化脱羧而来。γ-氨基丁酸是哺乳动物中枢神经系统中的重要的抑制性神经递质。具有重要的生理功能，已报道的生理活性有调节血压、促使精神安定、促进脑部血流、增进脑活力、营养神经细胞、增加生长激素分泌、健肝利肾、预防肥胖、促进乙醇代谢（醒酒）、改善更年期综合症等多种功效。

目前利用基因工程技术过量表达谷氨酸脱羧酶基因，来进一步提高GABA的产量的研究已有相关报道。在这个研究领域中，主要是将这些来源于GABA积累菌株的谷氨酸脱羧酶基因导入到大肠杆菌或枯草芽孢杆菌的某个野生型菌株中，并使谷氨酸脱羧酶在宿主菌中得到高效表达，从而增强宿主菌生产GABA的能力，但是采用该方法生产GABA，需要加入大量L-谷氨酸或L-谷氨酸钠作为前体物质，而L-谷氨酸或L-谷氨酸钠通常由谷氨酸棒杆菌发酵产生。因此，现有技术生产GABA的过程复杂且生产成本高。

发明内容

本发明提供了一种γ-氨基丁酸的生产方法，是将谷氨酸脱羧酶基因导入到谷氨酸生产菌中构建基因工程菌，利用基因工程菌分泌的谷氨酸脱羧酶将其自身积累的谷氨酸脱去一个羧基合成出γ-氨基丁酸。

具体方法如下：以谷氨酸棒杆菌 ATCC13032为出发菌株，它具有积累谷氨酸的能力，将谷氨酸脱羧酶基因gadB1导入到谷氨酸棒杆菌 ATCC13032中构建了重组谷氨酸棒杆菌，使得重组菌利用异源表达的谷氨酸脱羧酶gadB1将其自身积累的谷氨酸脱去一个羧基合成出γ-氨基丁酸。

所述谷氨酸脱羧酶基因gadB1来自产γ-氨基丁酸的短乳杆菌，该菌株已于2010年12月27日，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉、武汉大学，保藏编号：CCTCC NO：M 2010367，分类学命名：短乳杆菌Lb85(Lactobacillus brevis Lb85)。

该菌株是从本实验室系列乳酸菌中利用纸层析方法筛选得到的一株产γ-氨基丁酸的乳酸菌，通过镜检和16SrDNA鉴定，证实与GenBank中公布的各种短乳杆菌的16SrDNA的同源性为99%，从而确定该菌株为短乳杆菌。

所述谷氨酸脱羧酶基因gadB1是根据基因组全序列已公布的短乳杆菌 ATCC 367的谷氨酸脱羧酶基因为参照设计引物，以筛选出的这株产GABA的短乳杆菌的基因组为模板，利用PCR技术将其基因组中编码谷氨酸脱羧酶的基因gadB1扩增出来，并进行基因测序，其核苷酸序列如Seq ID NO .1。

本发明还提供了一种GABA的生产菌株，采用本实验室构建的大肠杆菌-棒状杆菌穿梭型诱导表达载体pDXW-8（专利申请号200910233618.1），将扩增出的目的基因gadB1连接到载体上，构建出谷氨酸脱羧酶重组表达质粒pDXW8-gadB1，将重组质粒通过电转化的方法导入到谷氨酸棒杆菌ATCC13032中，得到重组谷氨酸棒杆菌pDXW8-gadB1/ATCC13032。

发酵液中GABA的精确定量：氨基酸自动分析仪法。用5%三氯乙酸将发酵液稀释25倍后静止30min，12000rpm离心10min沉淀蛋白，取上清液，用日立L835-50型氨基酸自动分析仪检测。氨基酸自动分析仪采用 2619#树脂（阳离子交换柱f2.6×150mm），53℃分析，GABA用外标法定量。

本发明利用重组谷氨酸生产菌，将发酵产生的L-谷氨酸直接转变成γ-氨基丁酸，具有如下优点：

1）将谷氨酸的发酵和GABA的转化合二为一，简化了GABA生产步骤；

2）培养基以葡萄糖作为碳源、尿素等无机氮作为氮源，相对于需要外源添加L-谷氨酸或L-谷氨酸钠为前体物质的生物转化，生产成本明显降低。

附图说明

图1重组质粒pDXW8-gadB1的构建示意图。

具体实施方式

以下通过实施例来进一步阐明本发明，下列实施例用于说明目的而非用于限制本发明范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，基本上都按照常见的分子克隆手册所述的条件进行操作。

材料和试剂：