[发明专利]人来源的血管内皮生长因子121(VEGF121)原核表达和纯化的简便方法

说明书

技术领域

本发明涉及人来源的血管内皮生长因子121(VEGF121)原核表达和纯化的简便方法。

技术背景

肿瘤的生长和存活依赖于生成的血管为它提供的氧气和营养物质。早在1971年，Folkman等就提出可阻断肿瘤血管的生成来抑制肿瘤的生长及转移。这就使人们对于肿瘤血管生成和成熟有关的血管生成因子进行了大量的研究。

已有的研究已经发现与肿瘤血管生成有关的因子大约有30余种。其中，血管内皮生长因子(VEGF)及其受体(VEGFR)能特异的促进细胞分裂、增殖及迁移，在肿瘤新生血管生成过程中起着至关重要的作用。

VEGF是一个家族，包括VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E以及胎盘生长因子等；其中以对VEGF-A研究的最多。VEGF-A基因由8个外显子和7个内含子组成。经剪接后有5中不同单体，根据氨基酸的数目分别命名为VEGF121，VEGF145，VEGF165，VEGF189，VEGF206。

VEGF-A能够促进血管内皮细胞增殖。目前，已经明确的能促进内皮细胞增殖的主要是VEGF121和VEGF165。另外，还能增加血管通透性和促进血管支持物的生成。VEGF-A及其家族成员是近年来被认为在调节肿瘤血管生成中起重要作用的因子，临床治疗中的应用亦受到越来越多的关注。

受体VEGFR-1是为造血干细胞的招募和单核细胞和巨噬细胞的迁移工作需要，受体VEGFR-2调节血管内皮功能，VEGFR-3调节淋巴管内皮细胞的功能。目前，国际上以VEGF及其受体VEGFR为靶点治疗癌症是药物研究的热点；以期望克服当前癌症治疗药物普遍存在疗效不突出、易产生耐药性、副作用大的一些痼疾。

目前国际上大部分的VEGF蛋白是由真核细胞表达来获得的，其蛋白产量低，且下游的纯化分离工作繁琐，极不适合大规模生产。

发明内容

本发明的目的在于实现一种人来源的血管内皮生长因子121(VEGF121)原核表达和纯化的简便方法。通过人来源的血管内皮生长因子121(VEGF121)在原核细胞中的大量表达以及简便的纯化步骤，获得纯度高的目的蛋白。本发明所提供的工艺方案在工业生产中可满足生产周期短，生产成本低，蛋白产量高、产品品质高的总体要求。

本发明提供一种人来源的血管内皮生长因子121(VEGF121)原核表达和纯化的简便方法，其特征在于该方法通过如下步骤实现人来源的血管内皮生长因子121(VEGF121)原核 表达和纯化：

(1)将PCR人来源的血管内皮生长因子121(VEGF121)基因连接到表达载体pET-28a；

(2)利用菌液来培养pET28a-VEGF121质粒，再经过IPTG诱导表达目的蛋白；

(3)制备血管内皮生长因子121(VEGF121)包涵体；

(4)进行血管内皮生长因子121(VEGF121)透析复性；

(5)对血管内皮生长因子121(VEGF121)进行亲和纯化；

(6)通过凝胶过滤层析进一步纯化目的蛋白。

所述血管内皮生长因子121(VEGF121)是从大肠杆菌高效表达的包涵体中进行制备纯化的。

所述血管内皮生长因子121(VEGF121)的表达温度为37℃

所述血管内皮生长因子121(VEGF121)的纯化温度为室温或4℃。

所述经过纯化的血管内皮生长因子121(VEGF121)液氮冷激后于-80℃保存。

本发明通过体外PCR扩增的方法，从人来源的血管内皮生长因子121的cDNA中扩增得到VEGF121基因，并通过NdeI和EcoRI限制性酶切位点与表达载体pET-28a连接；然后将质粒转化入大肠杆菌BL21(DE3)获得高效表达。

本发明由于在构建血管内皮生长因子121的表达载体时，表达载体pET-28a本身在5’端带有6个组氨酸标签的核苷酸序列，从而使表达的重组蛋白氨基酸序列的5’端也带有一个6个组氨酸标签。这使得后续纯化实验中可采用镍亲和层析的方法，一步就可以获得比较纯的蛋白(纯度＞90％)，大大简化了纯化步骤，提高了蛋白的得率。