[发明专利]改进的大突变分析

说明书

技术领域

克隆负责仅通过表型界定的生物性状的基因（所谓的正向基因克隆）已成为遗传学和生物技术中长期的挑战。特别是在（作物）植物领域中，快速而经济的正向基因克隆方法是急需的。目前的要求是找到提高正向基因分离速度降低其成本，特别是扩展可以进行基因克隆的物种范围的方法。在具有含有大量重复DNA的大或无特征（uncharacterized）的基因组的物种中，基因克隆尤其繁重。这种物种是莴苣、胡椒、洋葱、韭菜、豆、小麦、黑麦、大麦以及许多其它的。

背景技术

正向基因克隆的目的是鉴别仅从表型获知，而没有或仅非常有限的分子信息或没有序列信息可获得的那些基因。正向遗传学的起点可以是例如天然存在的表型变体或人工诱导的突变体。

本质上，已经认识了两组正向基因克隆的方法：绘图（mapping）策略和标签（tagging）策略。这些策略是互补的，各自都存在其固有局限性。

在绘图策略中，通过标记辅助的减数分裂重组绘图将表型精确定点在染色体的最小片段上。基于绘图的克隆是非常繁杂的程序，特别可用在一小群模式物种上，对于该物种可获得其广泛的基因组信息，优选全基因组DNA序列。

理论上，基于绘图的克隆对于通过有性繁殖（cycle）而复制的任何生物体是普遍适用程序（Peters等人，(2003)Trends in Plant Science Vol.8No.10pp 484-491）。然而在实践中，存在基本的生物学限制。最重要的是，基于绘图的克隆关键取决于在感兴趣基因区域内减数分裂重组的良好频率。其次，这在特征很少的大基因组例如在植物如莴苣、胡椒、洋葱和许多其它基因组中变得越来越困难，因为在其中重复DNA构成了基因组的大部分，阻碍了DNA标记的清晰绘图以及阻碍了跨越遗传间隔的大的连续DNA序列的拼接。

在经典的标签策略中，良好特征的生物插入诱变剂（转座子或T-DNA插入）已被用作载体来克隆基因。将可转座元件插入基因中会导致功能丧失或获得、表达模式的变化、或对基因功能可以没有影响，这取决于插入片段是否占据例如基因的编码或非编码区。负责任何新产生的表型的基因经界定位于插入元件的两侧，并且因此通过沿着基因组DNA两侧片段找回插入序列而进行克隆。

通过插入突变的帮助进行加标签理论上是克隆基因的优选方法，因为这是快速的，并独立于减数分裂重组，而且不要求事先的基因组资源比如遗传图或大量的序列信息（见Maes等人，Trends Plant Sci.1999Mar；4(3):90-96）。通过加标签克隆突变的基因不受重复基因组序列或基因组大小的阻碍。

加标签方法在少数模式生物体中已经成功，在这些生物体中天然基因标签（转座子）体系是已知的，或大量个体可用随机整合DNA（T-DNA）进行转化（见例如Settles等人，BMC Genomics 2007,8:116，用玉米）。除了这一小群物种之外，标签不能或很难应用，由于缺乏已知的插入元件，或者由于群大小的逻辑限制。逻辑上，为了寻找一个或几个特异突变体，标签要求几千个个体的群，因为每基因组插入序列的数量很低（1-200）。

发明内容

本发明的目标之一在于提供一种新方法及其用途，其允许高效鉴别参与特定表型显现的核酸。该方法可以应用于任何可人工杂交和操作的（植物）物种，而无需该物种的广泛的减数分裂重组绘图和预先存在的基因组DNA序列知识。本发明的其他目标将明显地体现在本发明的说明书、实施方式和权利要求中。

定义

在以下说明书和实施例中使用了几个术语。为了在说明书和权利要求中提供明确且一致的理解，包括这些术语给出的范围，提供以下定义。除非此处另有定义，否则所有使用的技术和科学术语具有发明所属领域普通技术人员所通常理解的含义。所有发表、专利申请、专利和其它参考文献的公开通过引用其全部并入此处。

等位基因：在同源染色体上可以具有相同位置并负责可替换的性状的至少两个可替换形式基因的其中一个。非限制性实例是花中的花簇颜色基因——单个基因可控制花瓣的颜色，但是可能存在基因的几个不同版本或等位基因。一个版本可形成红色花瓣，而另一可形成白色花瓣。个体花的最终颜色取决于其拥有基因的哪两个等位基因以及两者如何相互作用。