[发明专利]校准试剂及其用途

说明书

在近年内开发和建立了反相蛋白质阵列（RPA）作为用于分析在微量生物学样品（例如细胞裂解物、组织裂解物或体液）中代表不同信号转导级联的关键分析物的聚焦的蛋白质组的便利方法。蛋白质表达的相对差异不仅代表特定关键蛋白质的丰度，而且代表这些关键蛋白质的活化的、翻译后修饰（例如磷酸化）形式，其可描述和分类例如对细胞培养物施加的药物化合物的特定处理效果，例如候选药物对激酶的抑制作用，或描述和分类不同疾病状态，例如肿瘤在其不同进展状态中的亚型。RPA可进行多个平行样品的比较测量，例如来自不同处理的细胞培养物的样品或来自不同疾病群体的样品。在不同样品组群中发现的蛋白质表达或蛋白质活化模式的显著改变将有助于例如鉴定最有效的候选药物，阐明处理诱发的作用模式方案，或发现新的诊断/预后疾病标记物。

免疫亲和测定，例如在反相蛋白质阵列（RPA）中使用的免疫亲和测定是基于亲和试剂和目的蛋白质之间的特异性相互作用。所述测定包括在阵列上固定生物学样品，形成样品点。将固定了样品的阵列与亲和试剂（即抗体）孵育，并通过产生的检测信号，例如发光信号测量随后形成的亲和试剂和目的蛋白质的复合物。使用分析物特异性亲和试剂对每个阵列染色，所述亲和试剂可被标记或与第二检测试剂孵育。通过多种手段（色度、荧光、化学发光等）检测形成的复合物。一般RPA测量不同样品之间的表达或活化信号的相对变化。

样品的定量分析需要使用校准试剂。目前用于蛋白质分析物的校准试剂是与分析物具有相同氨基序列的重组蛋白质。例如，专利申请WO2007/048436A1描述了用于反相蛋白质微阵列的校准曲线，其中对包含BSA或大鼠血清的点样缓冲液加入不同浓度的纯化目的蛋白质（Akt）。然而，产生呈现正确表位的重组蛋白质是费时的，且经常不成功。特别是对磷酸化的表位，目前没有可用的可靠校准试剂。

因此，需要设计提供具一般适用性的、对不同目的分析物表位具有可选择的特异性的试剂。所述试剂将允许校准例如在分隔的时间、由不同的实验室人员、在不同的设备或在不同的印记循环（print run）中构建的阵列上进行的实验结果。此外，可最佳地预定义由各个亲和试剂产生的蛋白质特异性RPA信号的线性范围。

因此，本发明提供了包含通过接头与蛋白质载体连接的肽的校准试剂，其中所述肽包含目的表位。优选地，所述目的表位是磷酸化的。

使用此校准试剂，可利用RPA或另一种亲和测定产生用于定量蛋白质的可靠的标准曲线。通常使用机器人微阵列点样仪（microarrayer）通过将小样品体积的例如细胞或组织裂解液沉积在高度结合性的基质表面上构建RPA。在基质上的每个裂解物点包含细胞蛋白质和分析物的全部成分（complement）。可在一个微阵列上平行点样数百个样品，以允许在同一测定中的样品的高通量交叉比较。因为每个点消耗的样品体积极低，可以从相同的最初体积的样品材料中容易地产生包含相同样品组的重复阵列。

本发明的校准试剂对定量包含磷酸化的目的表位的蛋白质特别有效。

术语“目的表位”指被目的亲和试剂识别的多肽部分。目的亲和试剂优选地对目的表位是特异性的。

如本文使用的术语“表位肽”指包含目的表位的肽。表位肽优选地为12至25个氨基酸之间的长度。更优选地，肽的长度是12至20，更优选地14至17个氨基酸的长度。

目的表位可被修饰，例如磷酸化。本文中使用的术语“磷酸化的表位”指包含至少一个具有磷酸基的氨基酸的表位。优选地，目的表位包含1至5个磷酸化氨基酸。优选地，修饰的氨基酸的位置大约在表位肽的中间。例如在15个氨基酸长度的肽中，修饰的氨基酸优选地在第7、8和/或9位（见图2C）。修饰氨基酸（例如磷酸化）的方法是本领域技术人员熟知的。

表位肽通过接头（见图1A）与蛋白质载体共价结合，其中所述表位肽与接头共价结合，接头与蛋白质载体共价结合。在一个优选的实施方案中，结合与BSA的游离的N-端半胱氨酸（Cys）基团共价结合，其中游离的Cys基团是未参与二硫键的半胱氨酸残基。

表位肽可基本在两步中与蛋白质载体连接：

步骤1）接头与表位肽缀合，其中所述接头优选用标签标记。接头可与肽的N-或C-端连接。优选地，接头与肽的N-端连接。

步骤2）接头的游离端与蛋白质载体缀合。