[发明专利]生产活的四倍体牡蛎的方法

说明书

技术领域

本发明的实施方式涉及以高效率生产活的四倍体牡蛎的方法。

背景技术

大多数有性繁殖的动物具有两组染色体，它们被称为二倍体。减数分裂是一种使染色体数量减半的过程，以避免各代的染色体数量加倍。这种过程有两个步骤，通过所述步骤，一个二倍体细胞变为四个单倍体细胞，每个单倍体细胞具有一组染色体。一个或所有四个单倍体细胞可以成熟为有功能的卵子或精子，其被称为配子。

四倍体牡蛎对于实现多种目的是重要的，包括三倍体、杂交和其它育种方案。已知的是，在二倍体牡蛎的正常繁殖期期间，与二倍体牡蛎相比，三倍体牡蛎具有更好的口味和更高的生长速度的商业优点。当前，已经利用特别的染色体组改变技术从正常的二倍体牡蛎生产三倍体牡蛎，其中卵母细胞中的减数分裂被改变，从而在第二次减数分裂期间在卵母细胞中保留第二极体，而不是从卵母细胞中排出。

细胞松弛素B(CB)和6-二甲基氨基嘌呤(DMAP)已知作为在受精卵的减数分裂期间防止第一极体(PB1)从细胞中排出的化合物。

然而，即使根据上述常规技术，已知还没有利用细胞松弛素B(CB)和6-二甲基氨基嘌呤(DMAP)的组合生产四倍体牡蛎的方法。

发明内容

因而，本发明的目的是提供以高效率生产活的四倍体牡蛎的方法。

为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了生产活的四倍体牡蛎的方法，包括步骤：用二倍体雄性牡蛎的精子使三倍体雌性牡蛎的卵受精；阻止第一极体从所述受精卵中排出；以及通过培养所述受精卵来生产活的四倍体牡蛎，其中阻止第一极体从所述受精卵中排出的步骤包括使所述受精卵接触细胞松弛素B(CB)和6-二甲基氨基嘌呤(DMAP)。

所述方法包括用二倍体雄性牡蛎的精子使三倍体牡蛎的卵受精的步骤。三倍体雌性牡蛎可以是商业上可获得的(Allen，Jr.，S.K.(1988)；Oceanus 31，58-63)。可以利用特别的染色体组改变技术从二倍体牡蛎生产三倍体牡蛎，其中卵母细胞中的减数分裂被改变，从而在第二次减数分裂期间在卵母细胞中保留第二极体，而不是从卵母细胞中排出。可以在产卵之前利用流式细胞计验证三倍体牡蛎的倍性。三倍体牡蛎的卵可以通过切开三倍体雌性牡蛎(剥离产卵(strip spawning))来采集。采集的卵可以用海水清洗并保持在合适的筛网上，例如25μm筛网。本发明的实施方式中使用的三倍体牡蛎可以通过将它们置于高温和富含饲料的环境中来调节。这种调节优选地在紧接着冬眠之后的配子发生的初始期开始。

接下来，用获自正常的二倍体雄性牡蛎的精子使所述卵受精。用于受精的精子可以包括每个卵约10个或多于10个精细胞。受精可以根据本领域已知的任何方法来进行，例如，在海水中使卵和精子接触。

所述方法包括阻止第一极体从受精卵中排出的步骤。这个步骤可以包括使受精卵接触细胞松弛素B(CB)和6-二甲基氨基嘌呤(DMAP)。

所述接触可以在受精卵排出第一极体的时间的30％～90％的时间范围内进行。此外，所述接触可以在卵受精之后进行5～15分钟。

阻止第一极体从受精卵中排出的步骤可以包括使受精卵同时接触细胞松弛素B(CB)和6-二甲基氨基嘌呤(DMAP)。此外，阻止第一极体从受精卵中排出的步骤可以包括使受精卵相继接触细胞松弛素B(CB)和6-二甲基氨基嘌呤(DMAP)。例如，阻止第一极体从受精卵中排出的步骤可以包括使受精卵接触细胞松弛素B(CB)以及然后使受精卵接触6-二甲基氨基嘌呤(DMAP)。例如，阻止第一极体从受精卵中排出的步骤可以包括在受精卵排出第一极体的时间的30％～90％的时间范围内使受精卵接触细胞松弛素B(CB)，然后在受精卵排出第一极体的时间的50％～90％的时间范围内使受精卵接触6-二甲基氨基嘌呤(DMAP)。更具体地，阻止第一极体从受精卵中排出的步骤可以包括在卵受精之后使受精卵接触细胞松弛素B(CB)5～15分钟，然后在卵受精之后使受精卵接触6-二甲基氨基嘌呤(DMAP)8.3～15分钟。

此外，阻止第一极体从受精卵中排出的步骤可以包括将受精卵加入到二甲亚砜(DMSO)中0.25～1.0ppm浓度的细胞松弛素B(CB)以及二甲亚砜(DMSO)中0.25～1.0ppm浓度的6-二甲基氨基嘌呤(DMAP)之中。例如，阻止第一极体从受精卵中排出的步骤可以包括将受精卵加入到二甲亚砜(DMSO)中0.25～0.75ppm浓度的细胞松弛素B(CB)以及二甲亚砜(DMSO)中0.25～0.75ppm浓度的6-二甲基氨基嘌呤(DMAP)之中。