[发明专利]变异LovD多肽及其用途

说明书

1.相关申请的交叉引用

本申请要求于2009年9月30日提交的美国临时申请61/247,253号和61/247,274号的权益，其所有内容通过引用以整体并入本文。

2.序列表引用

将根据37CFR§1.821以计算机可读形式(CRF)经由EFS-Web同时递交的文件名为CX2-022.txt的序列表通过引用并入本文。序列表的电子拷贝于2010年9月24日生成，其文件大小为52K字节。

3.背景

辛伐他汀(simvastatin)是可以从土曲霉(Aspergillus terreus)的发酵液分离的自然真菌聚酮(polyketide)洛伐他汀(lovastatin)的半合成类似物。辛伐他汀和洛伐他汀作为减少心脏病风险的降胆固醇药物：辛伐他汀作为而洛伐他汀作为均由Merck公司销售。

洛伐他汀(在图1中说明)是胆固醇生物合成途径中的限速酶羟甲基戊二酸辅酶A还原酶的强效抑制剂(Xie等人，2006，Chemistry & Biology13：1161-1169)。其类似物辛伐他汀(也在图1中说明)在高胆固醇血症治疗中更有效(Manzoni和Rollini，2002，Appl.Microbiol.Biotechnol.58：555-564；Istan和Diesenhofer，2001，Science 292：1160-1164)。用辛伐他汀中发现的α-二甲基丁酸侧链取代洛伐他汀的α-甲基丁酸侧链在降低不期望的副作用的同时显著地增加其抑制性质(Klotz，Ulrich，2003，Arzneimittel-Forschung 53：605-611)。

因为辛伐他汀的临床重要性，从洛伐他汀起始的不同的多步骤合成已经被描述(见，如WO 2005/066150；美国申请2005/0080275号；美国申请2004/0068123号；美国专利6,833,461号；WO 2005/040107；Hoffman等人，1986，J.Med.Chem.29：849-852；Schimmel等人，1997，Appl.Environ.Microbiol.63：1307-1311)。

用于洛伐他汀生物合成的基因簇之前已经被描述(见，如美国专利6,391,583号；Kennedy等人，1999，Science 284：1368-1372；Hutchinson等人，2000，Antonie Van Leeuwenhoek 78：287-295)。在该基因簇中编码46kD酶LovD，其催化洛伐他汀生物合成的最后一步。

简言之，模拟洛伐他汀化合物的部分的十氢化萘核部分与HMG-CoA部分通过洛伐他汀九酮合酶(LNKS)和三种辅助酶体内合成。洛伐他汀的2-甲基丁酸侧链通过洛伐他汀二酮合酶(LDKS)体内合成，并经由硫酯键共价连接到LovF的酰基载体域。酰基转移酶LovD继而能够在单个步骤中使2-甲基丁酸基团从LDKS向莫纳可林J(monacolin J)的C8羟基基团选择性地转移以生产洛伐他汀(Xie等人，2006，Chemistry & Biology13：1161-1169)。

最近已发现LovD酰基转移酶对酰基载体、酰基底物和十氢化萘酰基受体具有广泛的底物特异性(Xie等人，2006，Chem.Biol.13：1161-1169)。例如，LovD可以有效地催化酰基从CoA硫酯或N-乙酰基半胱胺(“SNAC”)硫酯向莫纳可林J转移(同上)。显著地是，在α-二甲基丁酰-SNAC被用作酰基供体时，LovD能够使莫纳可林J和6-羟基-6-去甲基莫纳可林J分别转化为辛伐他汀和huvastatin(同上)。使用被工程化以过表达LovD的大肠杆菌(E.coli)菌株作为全细胞生物催化剂，制备量的辛伐他汀在单个发酵步骤(同上)中合成。

以上研究证明LovD酰基转移酶是用于诸如辛伐他汀的药学上重要的降低胆固醇药物的生物合成的有吸引力的酶。然而，在使用分离的LovD酶进行的随后的实验中，稳定性和反应速率被证实是有问题的(Xie和Tang，2007Appl.Environ.Microbiol.73：2054-2060)。具体来说，发现LovD在高蛋白浓度(～100μM)容易(以小时计)沉淀，而在较低浓度(～10μM)缓慢(以天计)沉淀(同上)。此外，发现非常期待的产物辛伐他汀竞争LovD酶，显著地阻碍酰化的总净速率(同上)。