[发明专利]用于糖基化分析的糖肽的ES-MS

说明书

本文报告了用于免疫球蛋白糖基化分析的质谱方法，所述方法不需要层析分离步骤。

发明背景

对于很多重组产生的治疗多肽，多肽的糖基化是重要的特征。糖基化多肽，也称作糖蛋白，在真核生物例如人和一些原核生物中介导许多必需的功能，所述功能包括催化、信号转导、细胞-细胞间的通讯、免疫系统的活动、分子识别和关联。在真核生物中糖蛋白占非胞质蛋白质的大多数(Lis，H.，等人，Eur.J.Biochem.218(1993)1-27)。糖基化的引入是共翻译和翻译后修饰并且，因此不是遗传控制的。寡糖的生物合成是涉及一些酶的多步骤过程，所述酶为底物彼此之间竞争。因此，糖基化的多肽包含寡糖的微多相系列，产生一套含有相同的氨基酸主链的不同的糖形。已经报告了例如糖基化多肽的末端唾液酸化来增加治疗剂的血清半寿期，并且含有末端半乳糖残基的寡糖结构的糖基化多肽显示从循环中增加的清除(Smith，P.L.，等人，J.Biol.Chem.268(1993)795-802)。因此，在治疗多肽，例如免疫球蛋白的生物技术生产中，寡糖微多相性和它的批次与批次之间的一致性的评估是重要的任务。

免疫球蛋白在它们的糖基化上明显地与其他的重组多肽不同。例如免疫球蛋白G(IgG)是分子量约150kDa的对称的多功能的糖基化多肽。它由两个相同的负责抗原结合的Fab部分和负责效应功能的Fc部分组成。IgG分子在Asn-297处的糖基化倾向于高度保守，所述Asn-297埋藏在重链的CH2结构域之间，与CH2结构域内的氨基酸残基形成广泛的接触(Sutton，B.J.和Phillips，D.C.，Biochem.Soc.Trans.11(1983)130-132)。Asn-297连接的核心寡糖结构是多相加工的，以致特定的IgG存在多种糖形。在Asn-297位的位点占据上存在变化(宏多相性)或者在糖基化位点处的寡糖结构存在变化(微多相性)，见例如Jenkins，N.，等人，Nature Biotechnol.14(1996)975-981。通常，在IgG单克隆抗体中更丰富的寡糖组是无唾液酸双触角复杂类型聚糖，主要是无半乳糖基化(G0)，单-半乳糖基化(G1)，或双半乳糖基化(G2)类型(Ghirlandaio，R.，等人，Immunol.Lett.68(1999)47-52)。

考虑到糖基化在重组的糖基化多肽的功能性质上的重要性和成熟的并且一致的产品生产方法的必要性，在发酵过程中在线或者ad-line分析重组产生的糖基化多肽的糖基化谱是非常期望的。

Kuhlmann(Kuhlmann，F.E.，等人，J.Am.Soc.Mass Spec.6(1995)1221-1225)报告了后反相高效液相层析柱，其中将75％的丙酸溶液和25％的2-丙醇按照1∶2的比例加入到柱体流中。具有电喷射电离质谱(LCIMS)的高效液相层析和具有串联质谱(LC/MS/MS)的液相层析被应用到促红细胞生成素(EPO)中位点特异性的糖类多相性分析中(Kawasaki，N.，等人，Anal.Biochem.285(2000)82-91)。

在US 2006/0269979中报告了用于诊断和监测类风湿性关节炎和其他的自身免疫性疾病的高通量的聚糖分析。在WO 2009/048196中报告了糖蛋白的鉴定方法。在US 7,351,540中报告了蛋白质的分离和分析。Shaw等人报告了用于人激肽释放酶15的免疫荧光测定的发展(Clin.Biochem.40(2007)104-110)。

发明概述

一方面本文报告了确定免疫球蛋白的糖基化的方法，其包括以下步骤：

-酶促消化免疫球蛋白，

-将免疫球蛋白片段吸收到琼脂糖(Sepharose)珠上，

-用包含三氟乙酸的溶液洗涤具有吸收的免疫球蛋白片段的琼脂糖珠，

-从琼脂糖珠中回收免疫球蛋白片段，

-对回收的免疫球蛋白片段进行电喷射质谱，并且

-从质谱数据中确定免疫球蛋白的糖基化。

发明详述

本发明涉及用ES-MS确定免疫球蛋白糖基化的方法，所述方法不需要在免疫球蛋白的酶促消化之后和质谱分析之前的层析纯化步骤。