[发明专利]用于再生和转化树木的材料和方法

说明书

相关申请案的交叉参考

本申请案主张2009年5月7日申请的美国临时申请案第61/176314号的优先权，所述申请案的完整内容以全文引用的方式并入本文中。

技术领域

本技术大体涉及植物组织培养领域。具体说来，本技术提供用于增加从优良树种的顽拗型克隆或基因型再生芽的效率的方法。

背景技术

提供以下描述以便帮助读者获得了解。所提供的信息或引用的参考文献均不应视作本发明的现有技术。

植物遗传工程为改良商业上重要的植物物种提供了巨大潜力。近年来，树木遗传工程已经取得了进展，并且特别在制浆和木材工业获得了应用。存在若干种用于例如枫香树(sweetgum)、欧洲落叶松(European larch)、北美鹅掌揪(yellow poplar)和许多杨属(Populus)物种等物种的已确立的树木转化系统。在这些树种中已通过工程改造得到各种性状，例如抗虫性和除草剂耐受性。因此，对于包括桉树、松树和枫香树在内的商业上重要的树种来说，能够对树种进行遗传工程改造非常有利。

桉属(Eucalyptus)植物是包含超过500个物种的多种类植物。桉树的生长速率较高，适应多种环境，并且不易受虫害影响。除具有优越的生长性质外，桉树还是造纸工业中纤维的最主要来源。来自阔叶树种(例如桉树)的纤维一般比来自针叶树(例如松树)的纤维短得多。由桉树制造的较短纤维使得可制造出具有所需表面特征的纸浆和纸，所述表面特征包括光滑度和光泽度，以及低撕裂强度或抗拉强度。作为木材，桉树可提供具有中等到较高密度的高且直的木材。桉树木材具有多种用途；可用于胶合板和碎木板工业、家具工业；并且是木柴和建筑材料的来源。

大多数描述桉树转化的报导都使用桉树幼苗而非通过育种计划获得的优良基因型或克隆。举例来说，WO 99/48355描述一种用于转化巨桉(E.grandis)和赤桉(E.camaldulensis)的幼嫩叶片外植体的方法。虽然这一转化取得了成功，但利用所述方法存在两个主要问题。第一，这一再生方案可用于幼苗外植体，但其对来自优良基因型的外植体没有效果。第二，尽管利用了幼苗外植体和所提出的改良方法，但两个物种的子叶外植体以及赤桉下胚轴外植体的转化效率限制在2.2％或更低。胡(Ho)等人，植物细胞报告(Plant Cell Reports)17：675-680(1998)曾报导过一种改良的转化和再生方案；但即使利用赤桉幼苗也无法重复这一方案。培养数千个外植体，并产生转基因愈伤系，但回收的芽的数量极少。

尽管已经按常规方法进行了桉树无性系材料的微繁殖，但从头进行芽再生局限于幼苗，而不是商业上重要的桉树物种的所选择的或“优良”的克隆。通过连续数轮育种和选择得到的优良基因型对于经济上需要的性状的组合来说具有很高价值。与需要大量基因型来确保生长性状与转基因表达所赋予的所需性状共分离的幼苗转化不同，转化优良克隆将提供一种用于遗传工程改造树种的有效且有益的系统。优良基因型可根据利用大量起始基因型进行的多年无性系田间试验进行选择。与许多其它生长迅速的阔叶树树种相同，在可以相对准确地预测桉树的性状之前，将需要花费数年进行田间评估。因此，如果使用幼苗进行遗传工程改造，那么甚至将需要更多的基因型来成功地选择生长性状以及由转基因表达所赋予的所需性状。

发明内容

对于树木(例如桉树)的优良基因型或克隆，通常难以由外植体组织再生芽。由于转基因细胞的选择和发育需要再生过程，故这一再生过程缺乏或低再生效率导致这些优良基因型或克隆的遗传转化受阻。

按照惯例，已经通过使用例如BAP、玉米素(zeatin)、激动素(kinetin)、2ip和TDZ等生长调节因子实现了树种的芽再生。然而，对于某些优良种系来说，所提到的这些生长调节因子或组合不管是单独或是组合使用都未能在诱导芽再生方面取得成功。本文所述的方法描述了克服从育种计划选择的优良树木(例如桉树)的再生问题的方式。

本发明人发现了对于由优良基因型或克隆再生芽至关重要的培养基组分。因此，本发明大体涉及使用N⁶-(间羟基苯甲基)腺嘌呤(间拓扑林(meta-topolin))以及间拓扑林与其它植物生长调节因子的组合来促进以其它方式难以再生的优良树种的芽再生。尽管使用单独间拓扑林或其与其它生长调节因子的组合可有效诱导由某些优良基因型再生，但预期这些化合物也可改良其它基因型的再生效率。