[发明专利]用于纯化重组AAV载体的改进方法

说明书

相关申请的交叉引用

此申请要求2009年6月16日提交的美国临时申请序列号61/187,601的优先权，在此以其整体引入作为参考。

技术领域

本发明一般涉及重组腺相关病毒(rAAV)载体纯化的领域，该载体能够被用于基因转移且特别用于基因治疗或免疫。更特别的是，本发明涉及用于纯化重组rAAV载体的方法，该载体实质上不含生产工序内生产组分(如细胞核酸、细胞蛋白质、辅助病毒和培养基组分)。

背景技术

腺相关病毒(AAV)具有使其成为有效的基因治疗载体和遗传疫苗的独特性质。培养中细胞的AAV感染不引起细胞病变，而人类和其他动物的自然感染是隐性的、无症状的，并且和任何人类疾病的病因无关。而且，AAV感染包括很多哺乳动物细胞的广泛的细胞类型，使其可能针对体内许多不同组织。AAV感染缓慢分裂和不分裂细胞，而且基本上能作为转录活性的核附加体(染色体外因子)持续那些细胞的寿命。整合拷贝的rAAV载体在如肝或肌肉的器官内非常稀少。有效的长期基因转移已在多种细胞类型(包括眼睛、CNS和肌肉)中有报道，见例如X.Xiao等，J.Virol.70(11)：8098-8108(1996)；R.R.Ali等，Hum.MoI.Genet.5(5)：591-94(1996)。现在的临床研究大部分集中在血清型2rAAV载体的使用，但许多报道证实了其他AAV血清型(包括rAAV-1、rAAV-4、rAAV-5和rAAV-8)具有独特的体内生物分布，这使得它们成为在临床试验中试验的有效病毒血清型。

腺相关病毒(AAV)是复制缺陷性细小病毒，其单链DNA基因组长为大约4.7kb，包括145个核苷酸的反向末端重复(ITRs)。AAV血清型2(AAV2)基因组的核苷酸序列呈现在Srivastava等，J.Virol.，45：555-564(1983)中，由Ruffing等，J.Gen.Virol.，75：3385-3392(1994)修正。在ITRs内包含指导病毒DNA复制(rep)、壳体化/包装和宿主细胞染色体整合的顺式作用序列。三个AAV启动子(p5、p19、和p40，以它们的相对图谱位置命名)指挥编码rep和cap基因的两个AAV内部开放阅读框的表达。两个rep启动子(p5和p19)，连同在2107和2227位核苷酸的单个AAV内含子的差异拼接，导致自rep基因生产四个rep蛋白质(rep78、rep68、rep52和rep40)。Rep蛋白具有最终负责复制病毒基因组的多重酶性质。cap基因自p40启动子表达并且它编码三个衣壳蛋白质VP1、VP2和VP3。可变剪接和非共有翻译起始位点负责生产三个相关的衣壳蛋白质。一个单一共有多聚腺苷酸位点坐落在AAV基因组图谱95位。在Muzyczka，Current Topics in Microbiology and Immunology，158：97-129(1992)中综述了AAV的生活周期和遗传学。

AAV颗粒包括具有三个衣壳蛋白质VP1、VP2和VP3的蛋白质化衣壳，该蛋白质化衣壳由～4.6kb的线性单链DNA基因组包围。单独颗粒只包装一个DNA分子链，但此分子可能是正链或负链。含有任一链的颗粒是具感染性的，并以转换亲本感染单链为双链形式发生复制及随后的扩增，由此置换掉后代单链并包装进衣壳。AAV基因组的双链或单链拷贝(有时被称为“前病毒DNA”或“前病毒”)能被插入至细菌质粒或噬菌粒，并转染入腺病毒感染的细胞。关于AAV的一般综述见Carter，HANDBOOK OF PARVOVIRUSES，第一卷，169-228页(1989)和Berns，VIROLOGY，1743-1764页，Raven Press，(1990)。

rAAV载体生产通常需要四个普遍元素：1)用于复制的可感染宿主细胞；2)能由合适的辅助病毒(如腺病毒或单纯疱疹病毒)、或由包含最小腺病毒辅助功能的质粒构建体提供的辅助病毒功能；3)反式包装rep-cap构建体；和4)合适的生产培养基。