[发明专利]生产蛋白质的方法

权利要求书

1.生产目的蛋白质的方法，其包括将含有基因片段和位于所述基因片段两端的转座子序列的蛋白质表达载体导入悬浮性哺乳动物细胞，所述基因片段含有编码目的蛋白质的DNA和选择性标记基因；将插入在一对转座子序列之间的基因片段整合入所述哺乳动物细胞的染色体以获得能够表达目的蛋白质的哺乳动物细胞；和悬浮培养所述哺乳动物细胞。

2.生产目的蛋白质的方法，其包括下列步骤(A)至(C)：

(A)将下列表达载体(a)和(b)同时导入悬浮性哺乳动物细胞的步骤：

(a)含有基因片段和位于所述基因片段两端的转座子序列的表达载体，其中所述基因片段含有编码目的蛋白质的DNA和选择性标记基因，

(b)含有编码转座酶的DNA的表达载体，所述转座酶识别转座子序列并具有将插入在一对转座子序列之间的基因片段转移入染色体的活性，

(B)从步骤(A)中所导入的表达载体瞬间表达转座酶、以将插入在一对转座子序列之间的基因片段整合入哺乳动物细胞的染色体而获得能够表达目的蛋白质的悬浮性哺乳动物细胞的步骤，和

(C)悬浮培养步骤(B)中获得的能够表达目的蛋白质的悬浮性哺乳动物细胞以生产目的蛋白质的步骤。

3.获得能够表达目的蛋白质的悬浮性哺乳动物细胞的方法，其包括将含有基因片段和位于所述基因片段两端的转座子序列的蛋白质表达载体导入悬浮性哺乳动物细胞，所述基因片段含有编码目的蛋白质的DNA和选择性标记基因；和将插入在一对转座子序列之间的基因片段整合入所述哺乳动物细胞的染色体。

4.根据权利要求1至3任一项的方法，其中悬浮性哺乳动物细胞是能够在无血清培养基中存活和增殖的细胞。

5.根据权利要求1至4任一项的方法，其中悬浮性哺乳动物细胞是选自悬浮性CHO细胞、PER.C6细胞、大鼠骨髓瘤细胞YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20(或也称为YB2/0)和适于悬浮培养的悬浮性小鼠骨髓瘤细胞NS0的至少一种细胞，所述悬浮性CHO细胞中的CHO细胞适于悬浮培养。

6.根据权利要求5的方法，其中CHO细胞是选自CHO-K1、CHO-K1SV、DUKXB11、CHO/DG44、Pro-3和CHO-S的至少一种细胞。

7.根据权利要求1至6任一项的方法，其中选择性标记基因是环己酰亚胺抗性基因。

8.根据权利要求7的方法，其中环己酰亚胺抗性基因是编码人核糖体蛋白质L36a的突变体的基因。

9.根据权利要求8的方法，其中突变体是人核糖体蛋白质L36a的第54位脯氨酸被其它氨基酸取代的突变体。

10.根据权利要求9的方法，其中所述其它氨基酸是谷氨酰胺。

11.根据权利要求1至10任一项的方法，其中一对转座子序列是源自在哺乳动物细胞中发挥功能的一对DNA型转座子的核苷酸序列。

12.根据权利要求11的方法，其中源自一对DNA型转座子的核苷酸序列是源自一对Tol1转座子的核苷酸序列或源自一对Tol2转座子的核苷酸序列。

13.根据权利要求12的方法，其中源自一对Tol2转座子的核苷酸序列是含有SEQ ID NO：2所示核苷酸序列和SEQ ID NO：3所示核苷酸序列的核苷酸序列。

14.根据权利要求12的方法，其中源自一对Tol1转座子的核苷酸序列是SEQ ID NO：14所示核苷酸序列和SEQ ID NO：15所示核苷酸序列。

15.能够生产目的蛋白质的悬浮性哺乳动物细胞，其中导入含有基因片段和位于所述基因片段两端的转座子序列的蛋白质表达载体，以将插入在一对转座子序列之间的基因片段整合入染色体，所述基因片段含有编码目的蛋白质的DNA和选择性标记基因。

16.能够生产目的蛋白质的悬浮性哺乳动物细胞，其中同时导入含有基因片段和位于所述基因片段两端的转座子序列的表达载体(a)以及含有编码转座酶(转移酶)的DNA的表达载体(b)，以将插入在一对转座序列之间的基因片段整合入染色体，所述基因片段含有编码目的蛋白质的DNA和选择性标记基因，而所述转座酶识别转座子序列并具有将插入在一对转座子序列之间的基因片段转移入染色体的活性。