[发明专利]PIGGYBAC转座子变异及其使用方法

说明书

背景技术

本申请主张2009年2月25日申请的美国临时申请案案号61/155,206的优先权，所述美国临时申请案全文并入本申请做为参考。

把DNA导入细胞的典型方法包含例如磷酸钙的DNA浓缩剂试剂、聚乙二醇、含脂质的试剂，例如磷脂质、多层脂质体，以及由病毒为媒介的策略。然而，所述方法可具有一些限制。例如，DNA浓缩试剂与病毒媒介策略相关的大小限制。再者，在病毒策略中，可转染至细胞的核苷酸量有限制。并非所有方法都能促使进入的核苷酸插入细胞的核苷酸中，以及虽然DNA浓缩方法与含脂质试剂相对容易制备，但是插入核苷酸至病毒载体中需要大量劳力。病毒为媒介的策略可以是细胞形式或组织形式专一性，以及在体内使用病毒为媒介的策略可产生免疫问题。

解决这些问题的一种合适工具是转座子。转座子(transposons)或转座因子(transposable elements)包含(短的)核苷酸序列，具有终端重复序列上游与下游。有活性的转座子编码的酵素会促使核苷酸的切除与插入至目标DNA序列中。

转座因子代表许多真核基因组的实质部分。例如，～50％的人类基因组是衍生自转座因子序列，以及其它基因组，例如植物，可包含实质更高比例的转座因子衍生DNA。转座因子典型分为两类，第1类与第2类。第1类表示为反转录转座子(LINEs、SINEs、LTRs与ERVs)。第2类包含“剪与贴”DNA转座子，由终端反转重复(TIRs)定性，以及被因子编码的转座酶(transposase)动员(mobilized)。

目前，在真核细胞中，辨识10个超级家族的剪与贴DNA转座子(Feschotte and Pritham，2007)。

虽然第2类在许多真核细胞中广为分布且具有活性，但是已经被认为在哺乳动物基因组中转座性地不活化。这结论主要是基于人类与老鼠基因组序列的初始分析。虽然两个物种有许多不同的DNA转座子，但没有近代活性的显示(Lander et at.2001；Waterston et al.2002)。例如，在人类基因组中，有超过300,000个可辨识的DNA因子(elements)，它们被分为120个家族，并且属于5个超级家族。这些因子大部分(40个家族；～98,000复制(copies))合并在至少4-8千万年，但是没有证据显示任何人类DNA转座子家族比3万7千年年轻(Pace and Feschotte，2007)。

可在实验室条件下模拟水平基因转换的自然过程。在植物中，Ac/Ds与Spm家族已经时常转染至异质物种(heterologous species)中(Osborne and Baker，1995 Curr.Opin.Cell Biol.7，406-413)。然而，在动物中，活性转座子系统从一物种转换至另一物种的障碍是转换的物种专一性，需要自然宿主产生的要素(factors)。

无脊椎动物与脊椎动物的转座子在模式生物体中皆有转基因(transgenesis)与插入突变(insertional mutagenesis)的潜力。特别是在相同物种中其它转座子系统的可得性开启遗传分析的新可能性。仍需要新方法导入DNA至细胞中，以及特别是促进不同大小的转座子有效插入细胞核苷酸或是插入DNA至细胞基因组的方法，同时比目前技艺中可得的架构(construct)具更有效率的转录/转译结果。

发明概述

如下详细说明，已知在许多昆虫、鼠、猪与包含人类的哺乳类动物细胞中，粉斑夜蛾(Trichoplusia ni；cabbage looper moth)的piggyBac转座子是活性因子。本申请的发明人已经分离粉斑夜蛾piggyBac变异，比野生型(wildtype)的转座频率更高。高活性的转座子可用于基因转移统，把核苷酸稳定导入至细胞的DNA中。再者，本申请的发明人已经辨识合并缺陷piggyBac转移子(integration defective piggyback transposons)。本发明的基因转移系统可用于例如但不限于基因治疗、插入突变或基因发现的方法中。

因此，在第一方面，本发明特征在于包括一或多高活性piggyBac核苷酸序列的转座子，及其保留转座子活性的变异、衍生物与片段。在一实施例中，相较于野生型piggyBac转座子，高活性piggyBac转座子具有较高量的转座子切除(transposon excision)。