[发明专利]多能细胞的分化

权利要求书

1.用于将多能细胞分化为造血前体细胞或内皮细胞的方法，包括以下连续步骤：

(a)在含有至少一种生长因子的第一确定培养基中培养或维持多个实质上未分化的多能细胞；

(b)在不含或基本上不含BMP4、VEGF、IL-3、Flt3配体和GMCSF的第二确定培养基中温育细胞；

(c)在含有足以扩增多个细胞或促进其分化的量的BMP4和VEGF的第三确定培养基中培养细胞；和

(d)在含有足以扩增多个细胞或促进其分化的量的(1)IL-3和Flt3配体或(2)VEGF、FGF-2或FGF-2模拟物和IGF的第四确定培养基中培养细胞；

其中多个多能细胞分化为造血前体细胞或内皮细胞。

2.权利要求1的方法，其中所述第三确定培养基还包含FGF-2或FGF-2模拟物。

3.权利要求1的方法，其中所述第四确定培养基包含IL-3、Flt3配体和GMCSF。

4.权利要求1的方法，其中所述第四确定培养基包含IL-3、Flt3配体和下列的至少一项：IL-6、SCF或TPO。

5.权利要求4的方法，其中所述第四确定培养基还包含IL-6、SCF和TPO。

6.权利要求5的方法，其中所述第四确定培养基还包含血清替代物3。

7.权利要求6的方法，其中所述多能细胞是iPSC。

8.权利要求1的方法，其中在步骤(b)之前，至少部分分离或实质上个体化至少一些细胞。

9.权利要求8的方法，其中使用酶使细胞实质上个体化。

10.权利要求9的方法，其中所述酶是胰蛋白酶。

11.权利要求10的方法，其中在所述个体化之后将细胞与ROCK抑制剂和胰蛋白酶抑制剂接触。

12.权利要求11的方法，其中所述ROCK抑制剂选自HA-100、H-1152和Y-27632。

13.权利要求11的方法，其中所述胰蛋白酶抑制剂是大豆胰蛋白酶抑制剂。

14.权利要求1的方法，其中多个多能细胞形成类胚体(EB)。

15.权利要求14的方法，其中使用大约200至大约1000个细胞/聚集体以形成至少一个所述EB。

16.权利要求1的方法，其中所述方法包括在小于20％氧气的气压下培养细胞。

17.权利要求16的方法，其中所述方法包括在大约5％氧气的气压下培养细胞。

18.权利要求1的方法，其中所述细胞至少一次部分或实质上再聚集。

19.权利要求18的方法，其中在第三确定培养基中培养之后并且在第四确定培养基中培养之前或之时使所述细胞再聚集。

20.权利要求18的方法，其中所述再聚集包括将所述细胞暴露于胰蛋白酶或TRYPLE。

21.权利要求18的方法，其中所述细胞在再聚集之后暴露于ROCK抑制剂。

22.权利要求18的方法，其中在再聚集之后在基本上不含ROCK抑制剂的培养基中培养所述细胞。

23.权利要求18的方法，其中该方法还包括在小于大约20％氧气的气压下培养细胞，并且其中大约200至大约1000个细胞/聚集体用于形成多个类胚体(EB)。

24.权利要求1的方法，其中所述第三确定培养基或第四确定培养基包含血清替代物3。

25.权利要求1的方法，其中所述第一确定培养基包括TeSR、mTeSR或mTeSR1。

26.权利要求25的方法，其中步骤(a)包括在基质包被的表面上培养细胞。

27.权利要求26的方法，其中基质包括层粘连蛋白、玻连蛋白、明胶、聚赖氨酸、血小板反应素或Matrigel^TM。

28.权利要求1的方法，其中所述第二确定培养基包括TeSR-GF或X-vivo15培养基。