[发明专利]一种细胞的载体固定化方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种细胞的载体固定化方法。

背景技术

固定化技术是指利用各种理化方法将游离细胞或酶束缚在特定的空间区域内，提高细胞或酶的浓度，并保持生物活性和反复利用的一种技术。利用这种技术制得的细胞或酶称为固定化细胞或固定化酶。

酶技术常应用于生物大分子的水解以制备具有生理活性的各种小分子物质。然而游离酶在反应结束后，混在产物中增加了产物分离的难度，而且游离酶直接暴露在环境中，其催化活性受各种理化因素的影响较大。1916年Nelson和Griffin首先制备出固定化的酶，而直到1953年Grubhofer等人才真正开始有效的研究。与游离酶相比，固定化酶具有以下优点：酶的催化效率高；可重复利用，生产费用低；没有酶脱离到产物中，额外加工少；酶受到外界的影响小，酶的稳定性高；改善了酶的行为；能够实现连续化生产，可控性强，产品质量有保证；有利于多酶系统的利用。

然而，固定化酶技术仍然需要先将脂肪酶从细胞中提取出来，提取工艺通常比较复杂，而且酶在提取和固定化过程中容易失活。1959年，Hattori和 Furusaka 首次将大肠杆菌E.coli 吸附在树脂上，实现了细胞固定化。1973年，含有L-天冬氨酸酶的微生物被固定化，并用于L-天冬氨酸的生产。20世纪70年代末，动物、植物固定化细胞技术也得到了快速的发展。目前随着对细胞固定化技术的深入研究，固定化活细胞或称为固定化增殖细胞的研究工作几乎涵盖了所有的微生物发酵工艺，已有大量的研究文献发表，并且部分研究成果已应用于生产实践，比如啤酒生产、氨基酸、有机酸发酵、抗生素生产和污水处理等。

与固定化酶相比，固定化细胞主要具有以下几个优点：

一，不需要将酶从微生物细胞中提取出来并加以纯化，酶活力损失小、成本低。

二，细胞生长停滞时间短，细胞多、反应快，抗污染能力强，可以连续发酵，反复使用，应用成本低。

三，酶处于天然细胞的环境中，稳定性高。

四，使用固定化细胞反应器，可边加入培养液，边培养排出发酵液，能有效地避免反馈抑制和产物消耗。

五，适合于进行多酶顺序连续反应。

六，易于进行辅助因子的再生，因而更适合于需要辅助因子的反应，如氧化还原反应、合成反应等。因此，该技术的应用已经超过固定化酶的应用。

固定化细胞技术虽然具有广阔的应用前景，但大多是在实验室规模上进行研究，要真正实用化或工业应用，还有以下问题需要解决：

一，固定化细胞的稳定性问题，由于固定化的材料对微生物的毒性、固定化条件、固定化过程中的放热等都对细胞有影响而使部分细胞失活。

二，固定化细胞批量生产装置的开发，这是固定化细胞技术从实验室走向实际应用的重要一步。

三，廉价耐用的固定化载体及复合固定化技术的研究与开发。

四，高效固定化反应器的开发。固定化细胞技术主要依赖的是载体中处于固着态的细胞，如何使载体中固定足够多的细胞对于实现固定化细胞反应器的高效生产无疑具有着重要的意义。

细胞的固定方法按照固定的机制和支持介质主要可分为四种：表面吸附、包埋、膜固定、自聚集。表面吸附简单易行，但存在吸附率低、细胞易收环境影响的缺点；膜固定的方法适合于生产细胞外分泌的大分子物质，但产物和培养液成分容易在膜表面沉积，堵塞膜孔；自聚集的发生受培养液成分及培养条件的影响，但至今还不甚清楚；包埋法是当前工业上应用最多的固定化细胞的方法，其原理是使细胞扩散进入多孔性载体内部或将细胞包裹在凝胶网格结构中或半透性薄膜内，小分子底物和产物可以自由扩散，而细胞却不会扩散到周围介质中去。该法操作简单，对细胞活性影响小，尽管包埋材料会一定程度阻碍底物和氧扩散，并对大分子底物不适用，但仍是目前研究最广泛的固定化方法。以凝胶为包埋剂的固定化方法存在机械强度低、传质阻力较大的缺点，而采用多孔载体包埋细胞时，载体的载量及固着态细胞的分布不易控制。

发明内容

本发明涉及到的方法是针对采用多孔载体包埋细胞时存在的缺点加以改进而成的，目的是使载体中固着足够多的细胞并实现细胞在载体内的均匀分布。

本发明的目的通过以下技术方案实现：

一种细胞的载体固定化方法，其特征在于包括以下步骤：

1）  制备包含被固定细胞的种子液；

2）  制备适合细胞生长的培养液；

3）  在置于反应容器中的接种筒内注入培养液，直至培养液体积占反应容器体积的70%~80%，其中，该接种筒上下口密封，筒壁均匀分布通孔，筒外套接一整块呈中空圆柱状的载体；