[发明专利]一种改进的研究蛋白互作的双分子荧光互补载体

说明书

技术领域

本发明涉及一种载体以及制备该载体的方法，属于基因工程技术领域。

背景技术

蛋白互作是细胞中的一项基本生理作用，发生在所有亚细胞结构及细胞器中的每一个生理过程.阐明蛋白质的相互作用在何时、何地发生以及蛋白质复合物如何形成，能为确定蛋白质生物学作用提供决定性线索。

双分子荧光互补(bimolecular fluorescence complementation，BiFC)是利用荧光蛋白的发光原理研究蛋白互作的一项技术.其主要过程是将荧光蛋白切成N端和C端两部分，分别与目标蛋白连接，重组载体共转染细胞.若目标蛋白间存在相互作用，则会牵引荧光蛋白的N端片段与C端片段相互靠近，进而形成荧光蛋白生色团重新发出荧光.因此，在荧光显微镜下检测是否有互补荧光产生，即可推断出两目标蛋白是否发生了相互作用(图1)。与常用的研究蛋白互作的免疫共沉淀、表面等离子共振、酵母双杂交技术相比，BiFC具有简单直观等优点，已成为活细胞内研究蛋白质运动和功能的强有力工具。目前用于BiFC载体构建通常有两种方法。一种方法是先将荧光基因通过稀有限制性内切酶克隆到中间载体，然后再转移到双元表达载体。此方法存在一些不足之处：首先稀有限制性内切酶比较昂贵，而且不容易酶切与连接，这将大大增加研究过程中的难度。其次，先后连接到中间载体、双元表达载体，此过程比较复杂、繁琐。另一种方法是采用GATEWAY载体，此方法虽然快速、高效，但所用试剂价格昂贵。因此，采用一种低成本且高效的方法构建所需的载体是极其必要的。

发明内容

鉴于上述原因，本研究提供一种用于研究分子以研究双分子荧光互补的载体，该载体包括CaMV 35S启动子和CaMV 35S终止，在CaMV 35S启动子和CaMV 35S终止子之间包括cEYFP盒或nEYFP盒。

在一个具体的方式中，在cEYFP盒或nEYFP盒前插入有正向的CaMV 35S启动子，在cEYFP盒或nEYFP盒后插入正向的CaMV 35S终止子。

优选的，该载体包括如下结构；根据权利要求2所述的载体，其特征在于，该载体包括如下结构：EcoRI-XbaI-正向的CaMV 35S启动子-cEYFP盒或nEYFP盒-SalI-KpnI-BamHI-CaMV 35S终止子。

更优选的，该载体包括如下结构：该载体包括如下结构：EcoRI-XbaI-正向的2个CaMV 35S启动子-nEYFP盒-SalI-KpnI-BamHI-CaMV 35S终止子；和EcoRI-XbaI-正向的2个CaMV 35S启动子-cEYFP盒-pstI-SalI-KpnI-BamHI-CaMV 35S终止子-HindIII。

优选的，CaMV 35S终止子的序列包括SQ1；cEYFP盒的序列包括SQ：4；nEYFP盒包括SQ：2。优选的，利用该载体研究蛋白分子之间的互作功能。

另一方面，本发明提供一种构件用于研究双分子荧光互补的双元载体的方法，包括：(1)、提供基础载体pCAMBIA1301，将CaMV35s终止子通过Hind III/Xba I插入到pCAMBIA1301的多克隆位点，从而消除了位于Hind III和Xba I间的酶切位点，消除的酶切位点为Sal I、Pst I和Sph I；(2)用Xba I和EcoR I双酶切步骤(1)中获得的pCAMBIA1301-CaMV35s终止子载体，Xba I单酶切cEYFP盒-pMD18-T或nEYFP盒-pMD18-T，回收上述两种酶切产物；并将酶切产物进行粘性末端补平；(3)通过cEYFP盒或nEYFP盒连接至补平的pCAMBIA1301-终止子载体中，借此消除了pCAMBIA1301-35s终止子MCS上位于Xba I和EcoR I之间的酶切位点，包括BamH I、Sma I、Kpn I、Sac I、Ban II等酶切位点，同时也产生了新的Xba I和EcoR I酶切位点，挑取正向连接的克隆。这样产生了单个酶切位点而避免多酶切。在一个优选的方式中，CaMV 35S终止子的序列包括SQ1；cEYFP盒的序列包括SQ；4；nEYFP盒包括SQ：2。