[发明专利]鸡新城疫、禽流感(H9亚型)、传染性法氏囊病三联灭活疫苗的生产方法

说明书

技术领域

本发明是一种用于预防鸡的新城疫、禽流感(H9亚型)、传染性法氏囊病三种疫病的油乳剂疫苗制备方法，属于兽用生物制品领域。

背景技术

鸡新城疫(newcastle disease，ND)具有很高的发病率和病死率，世界各地多有发生，且一旦爆发将给禽养殖业带来毁灭性打击，是危害养禽业的一种主要传染病。OIE将其列为A类疫病(殷震、刘景华，1997.动物病毒学.北京.科学出版社)。

禽流感(H9亚型)(Avain Influenza H9 subtype)是由禽流感病毒(Avain Influenza virus)引起的、主要流行于动物和人类中的一种传染性、死亡率高的急性、高度传染性疾病，广泛发生于世界各地，对人类和养禽业危害很大(殷震、刘景华，1997.动物病毒学.北京.科学出版社)。

鸡传染性法氏囊病(Infectious bursal disease virus，IBD)是由双RNA病毒科中的传染性法氏囊病病毒引起的一种特殊疾病，损害幼鸡法氏囊。特征是腹泻、衰竭，法氏囊先发生显著炎症和增大，继之以萎缩，最后患鸡死亡。本病除造成一些雏鸡死亡外，还常引起病愈鸡免疫抑制，导致免疫接种失败，增加雏鸡对鸡新城疫等许多疾病的易感性(殷震、刘景华，1997.动物病毒学.北京.科学出版社)。

本发明人在已有的“鸡新城疫灭活疫苗”和“传染性法氏囊病基因工程亚单位疫苗”、“鸡新城疫-传染性法氏囊病二联苗”、“鸡新城疫-禽流感(H9亚型)二联苗”等产品的基础上，开展鸡新城疫、禽流感(H9亚型)、传染性法氏囊病三联灭活疫苗研究。

发明内容

本发明的目的是制备鸡新城疫、禽流感(H9亚型)、传染性法氏囊病的三种抗原，并进行合理配比制成鸡新城疫、禽流感(H9亚型)、传染性法氏囊病三种疫病的三联油乳剂疫苗(本发明又简称“三联苗”)，可以有效预防鸡新城疫、禽流感(H9亚型)、传染性法氏囊病的发生，同时也可以大大减少人们的劳动强度，降低养禽业养殖户的风险，而且保证了公众健康。

本发明涉及的三联苗技术的主要相关内容和所采用的技术手段：

(1)选育的新毒株经过血清学、分子生物学等试验进行大量的临床病料分析鉴定工作，最后选出HA效价高、免疫原性好并能抵御H9亚型各地方流行毒攻击的一株较理想的制苗用毒株。

(2)在传统全病毒灭活疫苗的基础上结合基因工程亚单位疫苗的复配，并且保证各单一病毒在联苗中均有和单苗一样的效果。

(3)利用美国进口的Millipore浓缩机将抗原经过超强浓缩，抗体产生快，效价高，保护期长，降低疫病的发生及蔓延。(浓缩机的生产厂家，美国密理博。型号为CUP50)。

(4)疫苗制备主要步骤为：

1)生产用菌毒种为La Sota株鸡新城疫病毒、YBF003株禽流感病毒(H9亚型)和E.coliBL21/pET28a-VP2株表达IBDV VP2蛋白的大肠杆菌基因工程菌；

2)分别按常规方法用鸡胚繁殖La Sota株鸡新城疫病毒和YBF003株禽流感病毒H9亚型，收获病毒液后经浓缩和灭活工艺制备成灭活病毒液；用加卡那霉素的LB液体培养基培养表达IBDV VP2蛋白的大肠杆菌基因工程菌E.coli BL21/pET28a-VP2株(本发明或简称为“基因工程菌”)，经过破菌、硫酸铵提取和灭菌工艺制备成表达的传染性法氏囊病毒VP2蛋白；

3)将以上制备的三种灭活抗原混合后按常规方法制备灭活佐剂疫苗。

本发明的详细描述

1.生产用种毒的来源

(1)鸡新城疫病毒La Sota株、效检用鸡新城疫强毒北京株(CVCC AV1611株)均购于北京市海淀区中关村南大街8号中国兽医药品监察所；

(2)表达IBDV VP2蛋白的大肠杆菌基因工程菌E.coli BL21/pET28a-VP2株(中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保管，菌株保藏编号为M204038，长江大学荣俊等提供，荣俊.IBDVVP2基因重组质粒Pbv220表达条件的优化。《动物医学进展》2007年第4期；荣俊.传染性法氏囊病重组亚单位疫苗免疫效力及安全性试验.《浙江农业科学》2007年第6期)；传染性法氏囊病病毒BC6-85株(CVCC AV7株)购于北京市海淀区中关村南大街8号中国兽医药品监察所；