[发明专利]一种培育抗水稻黑条矮缩病毒侵染植物的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种培育抗水稻黑条矮缩病毒侵染植物的方法。

背景技术

水稻黑条矮缩病毒(Rice black-streaked dwarfvirus，RBSDV)通过介体昆虫灰飞虱的传播，可以侵染小麦、水稻、玉米等禾本科植物，其中以对水稻和玉米的侵染为重。从以往的作物病史资料看，水稻黑条矮缩病毒并不是造成主要作物经济损失的主要病害。但是，由于最近几年气候和耕作制度的变化，水稻黑条矮缩病毒引起的水稻和玉米病害明显加重，在一些水稻产区发病率竟能达到90％。生产上的经验是籼稻品种表现出一定的抗性，且随品种不同差异较大，而粳稻普遍易感，整体而言，抗性品种匮乏。

目前研究表明，RBSDV侵染植物后，会表达出3种与病毒结构组分无关的非结构蛋白(non-structural protein，Pns)。特别是非结构蛋白Pns7-1会在病毒侵染到一定阶段时参与形成一种明显的管状结构。关于这种管状结构的作用、形成机制目前都是未知，但是可以肯定的是这个结构对病毒非常重要。因此以Pns7-1等非结构蛋白为突破口，是研究致病机理和积累抗性材料的理想选择。

随着植物转基因技术的发展，越来越多的文献报道了通过获得病毒蛋白的转基因植物进而研究其致病功能和机制的成功案例，其中最为著名的就是对病毒基因沉默抑制子的研究(R.Anandalakshmi，J.G et al.1998，Proc.Natl.Acad.Sci.USA95：13079；Brigneti G.，et al.1998，EMBL J.17：6739)；同时，自1991年Napoli等在转基因矮牵牛中发现基因的共抑制以来(Napoli，C.et al.1990，Plant Cell)，已发现基因沉默在植物、动物、微生物等的生物体中普遍存在，其中双链RNA最为一种重要的诱导信号，引起靶标RNA的特异降解，以此为指导，利用表达病毒蛋白基因反向重复序列从而获得抗病材料的文献也逐渐发表(Waterhouse P.et al.1998，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95：15939；Smith，N.A et al.2000，Nature 407：319)，其中又以构建靶标序列的发夹结构(在一段内含子两端分别连接一段序列和它的方向重复序列，转录时会形成双链RNA茎环)最为成熟。

发明内容

本发明的目的是提供一种培育抗水稻黑条矮缩病毒侵染植物的方法。

本发明提供了一个双链DNA片段，是式(I)所示的基因片段：

SEQ_正向-X-SEQ_反向；

(I)

其中，所述SEQ_正向如序列表的序列2所示，所述SEQ_反向与所述SEQ_正向反向互补；

X是所述SEQ_正向与所述SEQ_反向之间的间隔序列，X与所述SEQ_正向不互补且X与SEQ_反向不互补。

所述X可为内含子。常规内含子均可采用。所述内含子具体可为pSK-int载体的EcoR I位点和HindIII位点之间的内含子(pSK载体的EcoR I位点和HindIII位点之间的小片段)。

含有所述双链DNA片段的重组载体、转基因细胞系或重组菌均属于本发明的保护范围。

所述重组载体可为发夹中间载体。构建发夹中间载体时，可采用pSK载体作为骨架载体。所述发夹中间载体具体可为在pSK-int载体的Sac I酶切位点和EcoR I酶切位点之间插入所述SEQ_正向，HindIII酶切位点和Sal I酶切位点之间插入所述SEQ_反向得到的重组质粒(即在pSK-int载体的Sac I和EcoR I位点之间插入了序列表2所示双链DNA，HindIII和Sal I位点之间插入了序列表2所示双链DNA的反向互补序列得到的重组质粒)。