[发明专利]高温环境下海水鱼类体表粘液功能蛋白检测方法

说明书

技术领域：

本发明属于比较蛋白组学技术，是一种检测高温环境下海水鱼类体表粘液功能蛋白的方法。

背景技术

鱼类体表粘液是机体防御外界病原微生物入侵的第一道保护屏障，而体表粘液中含有的多种具有免疫功能的功能蛋白起着至关重要的作用，因此研究这些活性物质在高温环境下的变化规律，确定与温度相关的生物指示蛋白，将是一种新的更快捷的耐温选育途径。

本发明做出之前，Cristiane等(Analytical Biochemistry 2006)发表的Optimization of sample preparation from skin mucus of a neotropical fish for two-dimensional substrate gel electrophoresis，曾报道了利用双向电泳技术可以建立热带鱼Tambacu的体表粘液蛋白酶图谱，但并没有应用比较蛋白组学的技术确定与某些性状相关的功能蛋白；Frédéric Silvestre等(Science of the Total Environment 2010)发表的A proteomic analysis of green and white sturgeon larvae exposed to heat stress and selenium，曾报道了利用双向电泳技术比较分析高温胁迫对鲟鱼幼仔组织蛋白影响，但并没有将此技术应用于快速检测体表粘液的功能蛋白。综上所述，利用双向电泳技术检测高温环境下海水鱼类体表粘液功能蛋白的方法，目前国内外尚未见有报道。

发明内容：

本发明的目的是建立一套完整的检测高温环境对海水鱼类体表粘液功能蛋白影响的方法体系，利用双向电泳技术构建出体表粘液蛋白酶图谱，通过图谱分析从中筛选出与温度胁迫相关的功能蛋白，并结合个体高温耐受力情况，以期找到与温度胁迫相关的标记蛋白，为后期功能蛋白的研究提供依据，以及今后与传统方法结合进行耐温选育工作奠定基础。

本发明是按照以下操作技术方案完成的：具体步骤是：1、收集粘液；2、提取体表粘液蛋白；3、对蛋白含量进行测定；4、采用双向电泳分离蛋白；5、蛋白图谱分析；6、差异蛋白点切胶回收；7、质谱分析，确定功能蛋白。

1.收集粘液：是使用简便的无菌塑料吸管收集粘液。

2.提取蛋白：利用TCA/丙酮酸法提取海水鱼类体表粘液蛋白。

3.蛋白含量测定：按照Bradford蛋白浓度测定试剂盒操作说明测定。

4.双向电泳分离蛋白：

(1)等点聚焦电泳(一向)：选用pH4-7，17cm的线性胶条，样品最终稀释浓度为1μg/μl，上样量为300μl；等电聚焦程序：S1 Stp：300V，2h；S2 Stp：1000V，2h；S3 Grd：8000V，2h；S4 Stp：8000V，2h；S5 Grd：10000V，3h；S6 Stp：10000，1.5h；S7 Stp：500V，12h，根据等电点不同分离蛋白。

(2)聚丙烯酰胺垂直电泳(二向)：再次分离蛋白，其程序：起始时2W/块胶，45min后，将功率改为15W电泳4-5个小时根据重力原理进行分离；当溴酚蓝指示剂到达底部边缘时停止电泳。

(3)染色：将PAGE胶放入银染液中银染30min，加入显色液显色2-5min，加10％的冰醋酸溶液轻摇动终止染色，终反应即得到大菱鲆体表粘液蛋白酶图谱。

5.蛋白图谱分析：利用Imagemaster 2D Platinum 6.0图像分析软件进行图像分析，查找到差异显著的蛋白点。

6.差异蛋白点切胶回收：切割蛋白胶点，回收蛋白。

7.质谱分析，确定功能蛋白：进行MALDI-TOF-TOF质谱分析，采用PMF技术和MASCOT、NCBI网站提供的检索工具进行鉴定；确定与温度相关的功能蛋白。

本发明技术有以下特点：

(1)本发明可快捷的获得高温环境下，鱼类不同个体的体表粘液蛋白图谱，方法简便，所得结果可直观的检测出体表粘液蛋白在温度胁迫下的变化趋势，可迅速筛选出与其相关的功能蛋白，确定与温度相关的指示蛋白，从而进行辅助耐温选育研究。

(2)本发明在收集粘液的方法上做了革新，目前鱼类体表粘液收集方法有两种，一种是将鱼麻醉后放入装有无菌去离子水的灭菌袋中振荡，但该方法对鱼的伤害性较大，而且采集的粘液不能长时间保存，蛋白降解较快；第二种是利用灭菌玻璃片刮取粘液，但收集后分装比较困难，而本发明在收集粘液时用灭菌的塑料吸管，可以快速收集体表粘液，而且分装简单，并能够将其保存在-80℃中一年以上。