[发明专利]利用生物柴油副产物生产琥珀酸和聚羟基脂肪酸酯的方法

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程和微生物发酵及生物炼制领域，具体地说，涉及一种利用重组大肠杆菌发酵生物柴油副产物(甘油和以及残留在甘油中的脂肪酸)生产琥珀酸和聚羟基脂肪酸酯(PHA)的方法。

背景技术

琥珀酸，学名丁二酸，是一种具有重要应用价值的四碳二羧酸。琥珀酸作为30多种重要工业产品如1，4-丁二醇、四氢呋喃等的前体物质，被广泛应用于食品、医药、树脂聚合体、印染、化妆品等方面。目前琥珀酸的生产方法主要是化学法。由于环境问题，许多研究已经转向于微生物发酵来生产琥珀酸，以可再生资源为原料的琥珀酸发酵法将逐步取代传统的化学合成法。通过代谢工程构建以多种可再生碳源为底物的、易培养的、高转化效率、高产量的琥珀酸发酵菌株，提高微生物琥珀酸的产量、降低琥珀酸发酵成本具有巨大的应用潜力。。目前，研究较多的产琥珀酸微生物菌株有：产琥珀酸厌氧螺菌(Anaerobiospirillum succiniproducens)，产琥珀酸放线杆菌(Actinobacillus succinogenes)和大肠杆菌(Escherichiacoli)等菌种。

聚羟基脂肪酸酯(Polyhydroxyalkanoate，PHA)是细菌体内一种酯类的累积物，主要被用来作为碳源和能源的储备物。同时它是一类新型的天然高分子材料，具有良好的生物降解性、生物相容性、压电效应、光学活性等特点，已经应用于环保、医药等领域。同时，PHA有良好的生物可降解性，其分解产物可全部为生物利用，对环境无任何污染。PHA的熔融温度为175～180℃，是一种可完全分解的热塑性塑料。自然界中积累PHA的菌株主要是假单胞菌属(Pseudomonas)中的铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)和门多萨假单胞菌(Pseudomonas mendocina)等。其中，铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)研究的最多。铜绿假单胞菌中存在功能相似的II型PHA聚合酶phaC1和phaC2。在不良条件下生长时，铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)积累中长链的PHA。

大肠杆菌作为生产工业产物的宿主由于其遗传背景清楚、易操作、生长速率快、易培养及可利用多种碳源，而受到越来越多的重视。正是基于这些原因，大肠杆菌已经被广泛应用于发酵工程中，已知的通过代谢工程改造的大肠杆菌可成功地以葡萄糖等可再生的、廉价的碳源为底物发酵生产琥珀酸、乳酸以及乙醇等。大肠杆菌本身也不存在PHA合成和降解途径，通过基因工程可以将PHA合成途径构建在大肠杆菌内，从而实现利用大肠杆菌发酵生产PHA。

由于石油价格的上涨和环境污染的日益严重。生物柴油作为一个产业得到了各国的重视并迅速发展。而在生产生物柴油的过程中，特别是酶法合成生物柴油的过程中，甘油和甘油中的部分脂肪酸以副产物的形式而积累下来。如何变废为宝？如何同时有效利用甘油和剩余的脂肪酸转化为高附加值的生物材料或化工原料是一个重要问题。

发明内容

为了解决目前生物柴油生产过程中副产物甘油和甘油中的脂肪酸的回收和利用问题，本发明通过构建重组大肠杆菌，提供了一种利用重组大肠杆菌同时利用生物柴油生产过程中的副产物甘油和甘油中的脂肪酸生产琥珀酸和聚羟基脂肪酸酯(PHA)的方法。

本发明的技术方案是：利用基因工程改造大肠杆菌，在同一大肠杆菌菌株内构建同时利用甘油和脂肪酸发酵生产琥珀酸和PHA的合成途径(见图1)。

琥珀酸是三羧酸循环中间产物之一。以代谢流分析，本发明采用大肠杆菌缺失中长链脂肪酸代谢阻遏物基因(fadR)、短链脂肪酸代谢阻遏物基因(atoC)、碳源代谢途径中的磷酸转移酶系统II(ptsG)、琥珀酸脱氢酶基因(sdhA)及乙酸生成途径(Pta-ackA)缺陷型菌株发酵生产琥珀酸。fadR和atoC基因的敲除解除了对大肠杆菌利用脂肪酸包括短链脂肪酸的抑制作用，ptsG基因的敲除解除了分解代谢物的阻遏效应，同时减少了乙酸的生成；sdhA基因的敲除，使得琥珀酸不被氧化利用，从而在大肠杆菌细胞内积累下来；pta基因的敲除减少了乙酸的生成，增加了乙酰-CoA流向TCA循环，从而生成更多的琥珀酸。

PHA合成基于脂肪酸氧化中的中间产物3-羟基-脂酰-CoA，通过人为表达来自铜绿假单胞菌的PHA合成酶基因(phaC1)催化3-羟基-脂酰-CoA生成PHA。

本发明在同一大肠杆菌内构建了琥珀酸和PHA合成代谢途径，以生物柴油生产中的副产物甘油和甘油中的脂肪酸为底物发酵生产琥珀酸和PHA。