[发明专利]马肿瘤坏死因子超家族成员13B的cDNA序列及其克隆方法和重组应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物基因工程领域，具体涉及马肿瘤坏死因子超家族成员13B cDNA序列及其克隆方法和重组应用。

背景技术

人肿瘤坏死因子超家族成员13B（Tumor necrosis factor superfamily, member 13b，TNFSF13B）是1999年发现的一种与人体免疫调控密切相关的肿瘤坏死因子家族成员，主要在外周血单核细胞、脾脏、淋巴结和骨髓中表达。TNFSF13B具有很强的B细胞趋化性，体外它作为B细胞增殖和分化的共刺激因子，能诱导活化的B细胞分泌大量的IgG、IgA、IgM等，对于休眠B细胞, TNFSF13B虽不能独立激活使之进入细胞周期循环，但通过上调细胞表面的抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-X_L的表达，延长休眠B细胞的寿命。体内它可以促进脾脏内T1-B细胞向T2-B细胞以及成熟B细胞的发育。TNFSF13B的正常表达是GC形成、抗体亲和力成熟、记忆性B细胞形成及B细胞正常发育的必须条件。由于TNFSF13B具有多种重要免疫功能，自从被发现以来就显示了巨大的临床应用前景。2000年11月，美国FDA已正式批准重组人TNFSF13B进入人体临床试验，用于治疗普通变异免疫缺乏症（CVID）患者。

根据GenBank、EMBL和DDBJ国际三大核酸序列数据库搜索结果得知，马肿瘤坏死因子超家族成员13B (horse TNFSF13B) cDNA尚未被克隆，关于马TNFSF13B基因的研究在国内国外完全处于空白状态。 TNFSF13B对激活B细胞的促抗体分泌、促增殖的生物学活性强烈提示： TNFSF13B很可能像已成功应用于经济畜禽疫病防治的细胞因子免疫佐剂IL-2、CD40L一样，具有分子免疫佐剂样效应。 马TNFSF13B蛋白有可能开发成一种能增强马免疫能力的生物制剂。

近年来,随着对细胞因子研究的不断深入, 许多细胞因子基因工程药物上市,为家禽、家畜疾病治疗提供了新的手段, 同时创造了巨大的经济和社会效益， 因此重组马TNFSF13B蛋白具有巨大的潜在市场应用价值。

发明内容

本发明提供一种马肿瘤坏死因子超家族成员13B的 cDNA及其克隆方法。

本发明所说的马肿瘤坏死因子超家族成员13B cDNA，它具有SEQ ID NO.1所示的序列。

马肿瘤坏死因子超家族成员13B蛋白质具有SEQ ID NO.2所示的序列。

本发明的马肿瘤坏死因子超家族成员13B cDNA的克隆方法如下：

（1）根据马肿瘤坏死因子超家族成员13B基因5′ 和3′ 非翻译区序列设计Nest PCR引物：

第一轮PCR引物

正义1：5′- CGACAGCCAAGCTGGGCGATGTAGTC -3′（SEQ ID NO.3）

反义1：5′- CGCCCTACAGATGTGGGCACCGG -3′（SEQ ID NO.4）

第二轮PCR引物

正义2：5′- GGTCACTTATTCTAAAGGCCCGAACC -3′（SEQ ID NO.5）

反义2：5′- GACACCCTTTGGCTGTGGTTGTCGG -3′（SEQ ID NO.6）

（2）应用RNA抽提试剂TRIzol (Invitrogen 公司)，按照操作手册，提取马外周血总RNA；

（3）RNA逆转录为cDNA，以cDNA为模板，正义1和反义1为引物，进行第一轮PCR；以1:50稀释的第一轮PCR产物为模板，正义2和反义2为引物，进行第二轮PCR，扩增出一段cDNA序列，全长为1111 bp，克隆入pMD19-T载体，并对其碱基序列进行测序。

从马的外周血细胞总RNA中克隆得到的肿瘤坏死因子超家族成员13B (horse TNFSF13B) 的全长cDNA共1111 bp，其中开放阅读框 （open reading frame，ORF) 873 bp，分别含有46和192 bp的5′ 和3′ 非翻译区序列。 根据873 bp ORF 推测得到的TNFSF13B蛋白含有290 aa， 具有TNFSF13B家族共有的结构特点。体外功能试验证实重组马 TNFSF13B蛋白可刺激B淋巴细胞增殖。马TNFSF13B 1111 bp cDNA 和 290 aa序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。