[发明专利]一种虾过敏原标准物的制备方法

权利要求书

1.一种虾过敏原标准物的制备方法，其特征在于制备步骤为：

（1）脱脂

虾仁捣碎均质后，用60～90℃石油醚脱脂，按虾肉质量︰石油醚体积比W/V为1︰10，在低于60℃下进行搅拌萃取12h，4℃ 6000r/ min离心15 min，弃上清，沉淀置于通风橱使石油醚挥发得脱脂虾肉；

（2）浸提

将脱脂虾肉溶解于4℃预冷的0.05mol/L、pH7.4的磷酸盐缓冲液中，虾肉质量︰磷酸盐缓冲液体积比W/V为1︰20，4℃磁力搅拌4h，4℃ 7000r/min离心20 min，收集上清，得虾蛋白浸提液；

（3）饱和硫酸铵分级沉淀

在虾蛋白浸提液中缓慢加入硫酸铵，边加边搅拌，直至溶液中硫酸铵饱和度达30%，4℃磁力搅拌1h、静置1h，4℃ 8000r/min离心20min，离心后的上清液中继续缓慢加入硫酸铵直至饱和度达50%，4℃磁力搅拌1h、静置1h，4℃ 8000r/ min离心20 min，收集沉淀，用0.05mol/L、pH7.4的磷酸盐缓冲液复溶；

（4）凝胶过滤层析

将50%饱和度的蛋白组分装入透析袋，用0.05mol/L、pH7.4的磷酸盐缓冲液于4℃透析48h，然后使用AKTA蛋白纯化系统进行凝胶过滤层析；条件：经Superdex 75 10/300 GL凝胶柱层析，以0.05mol/L、pH7.4的磷酸盐缓冲液进行洗脱，流速0.35mL/min，2 mL间隔自动收集，280nm紫外吸收监测，收集所需出峰样品，合并后超纯水于4℃透析24h，样品冷冻干燥后即为所制备的虾过敏原蛋白标准品。

2.根据权利要求1所述的虾过敏原标准物的制备方法，其特征在于，第（1）步中所用石油醚为60～90℃的石油醚，第（2）步中获得的虾蛋白浸提液、第（3）步中获得的饱和硫酸铵分级沉淀组分、第（4）步中获得的凝胶过滤各峰组分都要进行变性聚丙烯酰胺电泳SDS-PAGE鉴定，电泳条件为：13.5%分离胶，5%浓缩胶，恒压100V，步骤（4）中冷冻干燥后获得的条带单一、相对分子量36kDa的蛋白质组分即为鱼过敏原标准物。