[发明专利]一种提取鱼类粘孢子虫基因组DNA方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种提取鱼类粘孢子虫基因组DNA方法。

背景技术

粘孢子虫指粘孢子纲(Myxosporea)的一大类原虫，是在海水及淡水鱼类寄生虫中种类最多、最为常见的一类孢子虫。粘孢子虫在发育过程中，无例外地产生种种形状和不同大小的孢子，故称为粘孢子虫。

国内外，粘孢子虫病的流行相当普遍和严重，至今仍未有比较有效的控制方法。常见的防治方法多采用生石灰和石灰氮作器具消毒。在中国各养鱼地区，流行着多种粘孢子虫病，例如鲢碘孢虫流行于浙江杭州地区以及江苏、湖北、湖南等省，它侵入白鲢的神经系统和感觉器官，使病鱼体瘦，尾巴上翘，上下打转，不久即死亡；饼型碘泡虫常大量侵袭草鱼苗的内脏组织和鳃，主要是肠道，严重危害草鱼苗的生产，这种病在中国以广东最为严重；流行于广东和广西的“埋坎病”，其主要病原体是野鲤碘泡虫。常出现在鲤、鲫鱼皮肤上的鲮单极虫，往往使鱼体布满白色点状或块状孢囊，严重影响鱼的生长发育，甚至引起死亡。

每一种粘孢子虫在寄主中有它的寄生部位。在淡水鱼类中，鳃、肠和胆囊是最常被侵袭的器官；海洋鱼类的胆囊和膀胱往往寄生1种或多种粘孢子虫。当粘孢子虫感染鱼体时会形成滋养体，滋养体继续发育，胞核反复多次分裂，形成几个孢母体(sporonts)。孢母体继续生长发育，其胞核也进行几次分裂，形成6～18个子核，最后形成孢子。滋养体继续生长，形成的孢子数目也随之增多。在滋养体周围的寄主组织，因不断受刺激而发生退化和改变，产生一层膜将滋养体包围，出现肉眼可见的白色粘孢子虫孢囊。

粘孢子虫的生活史还不完全清楚。对整个生活周期中核的变化、感染方法以及有无中间寄主等方面，也存在着较多的争论。有研究表明Myxobolus cerebralis、Ceratomyxa shasta的孢子不能直接感染鲑鱼，需要颤蚓科的蠕虫作为中间宿主，但是也存在鱼与鱼之间能够直接感染的粘孢子虫种类，如Enteromyxum等。

从鱼类宿主中分离粘孢子虫孢子并提取纯化基因组DNA是对粘孢子虫分类鉴定研究的基础；同时也是防治孢子虫感染的重要研究基础和发展方向。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种提取粘孢子虫基因组DNA方法。

本发明提供的提取粘孢子虫基因组DNA方法，包括如下步骤：

1)将粘孢子虫孢子研磨成粉，加入提取液混匀，得到混合液；

2)向步骤1)的混合液中加入氯仿异戊醇混合液混匀、离心，收集上清液；

3)向步骤2)得到的上清液中加入氯仿异戊醇混合液混匀，离心，收集上清液；

4)向步骤3)得到的上清液中加入异丙醇混匀，静置，收集沉淀；

5)将步骤4)得到的沉淀依次进行漂洗、干燥、溶解、RNA消化，得到消化产物；

6)将步骤5)得到的消化产物依次用酚氯仿异戊醇混合液和氯仿异戊醇混合液进行抽提，离心、收集上清液；

7)向步骤6)得到的上清液中加入3MNaAc水溶液和无水乙醇混匀，静置，离心，收集沉淀，得到DNA。

步骤1)中，所述提取液与所述粘孢子虫孢子的配比为(10ml-50ml)∶(1.5g-2g)，所述提取液与所述粘孢子虫孢子的配比具体为(10ml、40ml或50ml)∶(1.5g、1.8g或2g)；

步骤2)中，所述步骤1)的混合液和所述氯仿异戊醇混合液的体积比为1∶(1-2)，所述步骤1)的混合液和所述氯仿异戊醇混合液的体积比具体为1∶1、1∶1.5或1∶2，

步骤3)中，所述步骤2)的上清液和所述氯仿异戊醇混合液的体积比为1∶(1-2)，所述步骤2)的上清液和所述氯仿异戊醇混合液的体积比具体为1∶1、1∶1.5或1∶2，

步骤4)中，所述步骤3)得到的上清液和所述异丙醇的体积比为(1-3)∶(1-2)；所述步骤3)得到的上清液和所述异丙醇的体积比具体为1∶1、3∶2或3∶1；所述异丙醇的温度为-20℃；

步骤5)中，所述漂洗为依次用75％(体积百分含量)乙醇水溶液、75％(体积百分含量)乙醇水溶液和无水乙醇进行漂洗；

所述溶解的方法为用TE缓冲液溶解所述沉淀得到溶液A，

TE缓冲液由溶质和溶剂组成，所述溶质为Tris碱、EDTA，所述溶剂为水，所述Tris碱在所述TE缓冲液中的浓度为10mM，所述EDTA在所述TE缓冲液中的浓度为1mM，用盐酸调PH值至8.0。

所述消化的方法为向所述溶液A中加入RNaseA得到消化产物，RNaseA加入量为20mg/l溶液A；

步骤6)包括如下步骤：