[发明专利]一种弓形虫检测试剂盒及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种弓形虫检测试剂盒及其应用。

背景技术

弓形虫病是由刚地弓形虫引起的一种人畜共患的原虫病。弓形虫可感染多种动物：45种哺乳动物，70种鸟类和5种冷血动物。猫和猫科动物是弓形虫的终末宿主，在终末宿主体内弓形虫主要侵袭小肠上皮细胞，造成肠道疾病。而在中间宿主(如猪、牛、羊等)体内，弓形虫侵入肠壁经血液或淋巴进入单核巨噬细胞系统的细胞内寄生，并扩散到全身各处组织器官，如脑、淋巴结、肝、心、肺、肌肉等，造成全身多器官性的病变，对中间宿主的危害相当大。猪是弓形虫的主要易感动物，据有关报道显示，我国猪场的弓形虫感染率最高，约26.6％，最高可达60％。

现有的弓形虫检测方法很多，大致可以分为三大类，即病原学诊断方法、血清学诊断方法和分子生物学诊断法。病原学诊断方法包括组织学诊断、动物接种试验和细胞培养法。病原学诊断需要一定数量实验动物，而且实验周期较长。血清学诊断方法包括美蓝染色试验(DT)、间接荧光抗体试验(IFAT)、凝集试验和酶联免疫吸附试验(ELISA)。分子生物学诊断方法主要是聚合酶链式反应(PCR)，该方法比前两种方法快速，灵敏，但需要使用特殊的PCR仪，不适于基层应用。

发明内容

本发明的目的是提供一种弓形虫检测试剂盒及其应用。本发明提供的试剂盒基于环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)技术，可以快速检测弓形虫。

本发明提供了检测弓形虫的专用引物，由以下三对环介导等温扩增所用引物组成；一对引物是与弓形虫基因组中GenBank Accession Number AF146527基因(核苷酸序列如序列表的序列1所示)结合的内侧引物对，一对引物是与弓形虫基因组中GenBankAccession Number AF146527基因结合的外侧引物对，一对引物是与弓形虫基因组中GenBank Accession Number AF146527基因结合的环形引物对。

所述专用引物的靶区域具体可为序列表的序列1自5’末端第301-511位核苷酸所示的DNA。

所述内侧引物对由上游引物FIP和下游引物BIP组成，所述上游引物FIP的核苷酸序列具体可为序列表中的序列4，所述下游引物BIP的核苷酸序列具体可为序列表中的序列5；所述外侧引物对由上游引物F3和下游引物B3组成，所述上游引物F3的核苷酸序列具体可为序列表中的序列2，所述下游引物B3的核苷酸序列具体可为序列表中的序列3；所述环形引物对由上游引物LF和下游引物LB组成，所述上游引物LF的核苷酸序列具体可为序列表中的序列6，所述下游引物LB的核苷酸序列具体可为序列表中的序列7。

F3：5’-TGGGAAGCGACGAGAGTC-3’(序列表的序列2)；

B3：5’-TGGATTCCTCTCCTACCCCT(序列表的序列3)；

FIP：5’-CCGGTGTCTCTTTTTCCACCCTTTTTTCGGAGAGGGAGAAGATGTTT-3’(序列表的序列4)；

BIP：5’-TCGTGGTGATGGCGGAGAATTTTCCTCCTCCCTTCGTCCAA-3’(序列表的序列5)；

LF：5’-GGAAAAGCAGCCAAGCCG-3’(序列表的序列6)；

LB：5’-GAATTGAAGAGTGGAGAAGAGGGCG-3’(序列表的序列7)。

应用所述专用引物检测弓形虫的原理如下：

根据弓形虫GenBank Accession Number AF146527基因(序列表的序列1)部分区域(序列1自5’末端第301-511位核苷酸)设计一组用于环介导等温扩增的引物，即内侧引物对(内侧上游引物FIP和内侧下游引物BIP)、外侧引物对(外侧上游引物F3和外侧下游引物B3)和环形引物对(环形上游引物LF和环形下游引物LB)。三对引物和所述区域变异区域的八个特定区域的序列完全配对(见表1)，可以确保反应的彻底进行，也保证了检测方法的特异性。

表1专用引物与序列1所示基因的结合区域

所述专用引物在具有高度链置换催化活性的DNA聚合酶的作用下可完成对模板DNA的扩增。扩增过程分为三个阶段，具体如下：

(1)循环起始阶段