[发明专利]转基因奶牛早期胚胎性别鉴定的分子生物学方法

说明书

技术领域

本发明属于动物繁殖技术领域，具体涉及牛早期胚胎性别鉴定领域。

背景技术

为了充分发挥转基因奶牛的潜力，扩大转基因奶牛的规模，可以通过胚胎移植技术来提高转基因奶牛的繁殖速度，并且通过胚胎移植技术可以大大降低生产转基因奶牛的成本。对转基因奶牛早期胚胎进行性别鉴定，再进行移植，可以便外源基因有效的遗传给下一代，在生产中具有重要的科学研究价值和商业价值。

到目前为止，性别控制的方法主要分为两个方面：一是X、Y精子的分离技术，结合人工受精，来控制后代性别，但目前分离速度太慢(1.8×107个/h)，精液价格昂贵，且分离后精液不耐冷冻，后代有一定的畸形率，因而应用受到限制。一是通过胚胎性别鉴定，结合胚胎移植来进行性别控制。家畜胚胎的性别鉴定已成为家畜胚胎移植技术的一项重要内容。用分子生物学方法鉴定家畜胚胎性别是20世纪80年代后期才开始的。目前，已被国内外研究人员广泛应用于家畜，尤其是牛胚胎的性别鉴定。其主要方法有：雄性特异性DNA探针检测法、PCR扩增DNA片段检测法、PCR扩增SRY法等。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术存在的缺陷，研究出一种可在牛生产实践中推广应用的快速、简便的鉴别方法，并通过该发明加快转基因奶牛生产。

实现本发明的技术方案是：

1、试样的制备与保存

从待检牛胚胎中分离4～6个细胞，用无菌超纯水冲洗3次后，放入0.5mL PCR管中，加入10uL无菌超纯水，100℃煮沸10min～15min，立即置于碎冰中，冷却后在4℃下离心5min，取上清液保存于4℃冰箱中备用。

2、引物设计

根据牛Y染色体和常染色体基因序列设计引物，利用生物学引物设计软件Primer 5，设计PCR扩增引物。

引物序列如下：

Y-染色体特异性引物    正向：5′-TGATAGTTGATCCCACAGAAGG-3′

                      反向：5′-TGAACTTACAAGCAGCTGAGG-3′

常染色体特异性引物    正向：5′-TGAGGCATGGAACTCCGCTTG-3′

                      反向：5′-GGTGGTTCCACATTCCGTAGG-3′

3、PCR反应

以Y-染色体特异性引物和常染色体内标引物扩增，PCR扩增的反应体系总体积为20uL，其中10×PCRBuffer 2uL，4dDNTP的浓度均为200pmol/L，引物浓度为5～20pmol/L，Tap酶2.5U，模板DNA10～100ng/uL。反应程序为94℃预变性5min；94℃变性30s；53℃退火25s；72℃延伸30s，共进行30个循环；最后在72℃延伸5min。

4、PCR扩增产物检测

取5uL PCR扩增产物，1％～5％琼脂糖凝胶电泳，所述的条件是3V/cm～5V/cm，电泳20min～50min，用溴化乙锭染色，凝胶成像系统检查，电泳图参见附图1。

5、结果判定

检测电泳图谱中是否出现131bp和250bp两条带；如果电泳图谱中出现131bp和250bp两条带，即判定为雄性胚胎；如果只出现250bp条带，即可判定为雌性胚胎。

附图说明

图1为DNA样鉴定性别的电泳图

具体实施方式

1、试样的制备与保存

从待检牛胚胎中分离4～6个细胞，用无菌超纯水冲洗3次后，放入0.5mL PCR管中，加入10uL无菌超纯水，100℃煮沸10min～15min，立即置于碎冰中，冷却后在4℃下离心5min，取上清液保存于4℃冰箱中备用。

2、引物设计

Y-染色体特异性引物    正向：5′-TGATAGTTGATCCCACAGAAGG-3′

                      反向：5′-TGAACTTACAAGCAGCTGAGG-3′

常染色体特异性引物    正向：5′-TGAGGCATGGAACTCCGCTTG-3′

                      反向：5′-GGTGGTTCCACATTCCGTAGG-3′

3、PCR反应