[发明专利]一种快速检测绵羊多胎FecB基因的方法

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物技术领域，尤其涉及一种Tetra-primer ARMS-PCR快速检测绵羊多胎FecB基因的方法。

背景技术

单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)是最具有潜力的第三代分子标记，在多态性研究、基因图谱构建、表型性状和疾病连锁分析中具有重要作用。而SNP检测是当前国际上研究的热点，已经开发出许多商品化和专门化的仪器。目前，用于检测SNP的方法有很多种，但各有优缺点，在具有快速和高通量的同时仍存在一些不足，主要表现为样品前处理要求高，试剂昂贵且多数必须依赖于仪器生产商，少量样本检测成本高等不足，因此不利于在普通实验室和生产中推广应用。

2001年前后，国外三个研究小组几乎同时发现控制Booroola美利奴羊多胎的主效基因即FecB基因，该基因是绵羊6号染色体上骨形态发生蛋白受体IB基因(Bonemorphogenetic proteins receptor type IB，BMPR-IB)编码区746位上发生了A→G突变。通过序列测定和PCR-RFLP的方法可以实施对该基因的检测，且已用于多胎绵羊早期分子标记辅助选择。我国较早在关于绵羊多胎FecB基因研究中也是采用了这些方法(王根林等，2003；柳淑芳等，2003)。但该方法相对比较繁琐且所用内切酶的价格较高。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足提供一种快速检测绵羊FecB基因的方法。

一种快速检测绵羊多胎FecB基因的方法，利用特异性上游引物F1、下游引物R1和参照上游引物F2、参照下游引物R2共同对待测绵羊基因组DNA扩增，然后对PCR扩增产物进行电泳分析，确定序列扩增产物中条带大小和数目；其中，

上游引物F1：5′--GCTGGTTCCGAGAGACGAAAATATAGCG--3′；

下游引物R1：5′--GTTTTCATGCCTCATCAACACCGGCT--3′；

参照上游引物F2：5′--TCAGATGGTGAAACAGATTGGAAA--3′；

参照下游引物R2：5′--AGAAAGAGAGGAAAGCTAGGAAACC--3′。

所述的快速检测绵羊多胎FecB基因的方法，所述PCR扩增条件为：PCR反应总体积20μL，其中：基因组DNA 50～100ng，10×buffer 2μL；MgCL21.5mmol/L；dNTP浓度().2mmol/L；DNA Taq酶1.0U；特异引物F1和R1各20pmol；参照引物F2和R2各5pmol；加双蒸水至20μL；PCR反应程序：94℃预变性5min；94℃30s，62℃30s，72℃30s，循环30次；72℃延伸5min。。

所述的快速检测绵羊多胎FecB基因的方法，所述电泳分析中，取PCR产物8μL经10％聚丙烯酰胺凝胶电泳，银染显色。

应用本方法对PCR-RFLP(即限制性酶切片段长度多态性)和测序方法已经测试的109份绵羊样品DNA进行检测，其结果表明，前两种方法结果完全一致，即湖羊均为BB基因型，美利奴羊均为++基因型，而美利奴羊和湖羊杂交F1代均为B+基因型。因此，准确性很高。

本发明建立了一种简便易行、耗时短、结果易于判读、用以检测绵羊FecB基因突变的新方法，以提高测定FecB基因型的效率，使之易于在实践中推广和应用于大规模群体的检测。

附图说明

图1为四引物ARMS PCR法检测绵羊FecB基因的电泳图谱。

具体实施方式

以下结合附图和具体实施例，对本发明进行详细说明。

1.1材料与试剂

用于研究的湖羊样品采自上海永辉种羊场(87只)，并以该场引进的德国美利奴羊(6只)以及和湖羊杂交F1代(16只)作为对照。每只羊在耳尖部用75％酒精棉球消毒后用耳缺钳取耳皮肤组织约5g，酚-氯仿法抽提基因组DNA，-20℃保存备用。Taq DNA聚合酶和dNTP及PAGE凝胶电泳和染色等其它试剂均购自南京生兴生物技术公司。

特异性引物设计

(a)：下游引物：

BB型基因组：5′-TATCGACGGTGTTGATGAGGCATGAAAACATCTTGGGCTTCATT--3′

++型基因组：5′--TATCGACGGTGTTGATGAGGCATGAAAACATCTTGGGCTTCATT--3′