[发明专利]一种二代高通量测序的不对称DNA双链接头及其应用

说明书

技术领域：

本发明涉及一种二代高通量测序的不对称DNA双链接头及其应用。

背景技术：

2005年底，454公司推出了创新性的基于焦磷酸测序法的超高通量基因组测序系统Genome Sequencer 20 System。2007年又推出了性能更优的第二代基因组测序系统：Genome Sequencer FLX System。454的高通量测序技术，在测序时，使用了一种叫做“Pico TiterPlate”(PTP)的平板，它含有160多万个由光纤组成的孔，孔中载有化学发光反应所需的各种酶和底物。测序开始时，放置在四个单独的试剂瓶里的四种碱基，依照T、A、C、G的顺序依次循环进入PTP板，每次只进入一个碱基。如果发生碱基配对，就会释放一个焦磷酸。这个焦磷酸在各种酶的作用下，经过一个合成反应和一个化学发光反应，最终将荧光素氧化成氧化荧光素，同时释放出光信号。此反应释放出的光信号实时被仪器配置的高灵敏度CCD捕获到。有一个碱基和测序模板进行配对，就会捕获到一分子的光信号；由此一一对应，就可以准确、快速地确定待测模板的碱基序列。

测序实验流程的关键步骤是DNA样品的文库制备。454平台的文库制备的标准方法是：将基因组DNA或转录组逆转录成的cDNA打断并选择400-800bp的片段。经末端修复后，与两种不同的接头A和B(B接头带有生物素(Biotin)进行平头(blunt-end)连接(ligation)，结果形成三种不同接头组合的片段：AA，AB，BB。对连接(ligation)产物经过与链霉抗生物素蛋白(Streptavidin)的磁珠粘连、洗脱、碱变性、再洗脱等处理步骤，最后回收到两端是A和B接头序列的单链DNA(sstDNA)，用于下一步的乳胶化PCR(emulsion-PCR)和焦磷酸测序反应。

454测序DNA样品的文库制备，对DNA/cDNA的样品量要求较大，至少5微克样品。同时，DNA样品的文库制备的技术的效率较低，像平头(blunt-end)连接本身效率低；50％的连接(ligation)产物(AA、BB)无效；并且步骤较繁琐，需要对DNA量进行多个步骤的检测，不但需要昂贵的仪器，像Agilent(美国公司)的2100Bioanalyzer(仪器名)，还要消耗很多耗材和试剂。

发明内容：

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种二代高通量测序的不对称DNA双链接头及其应用。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种二代高通量测序的不对称DNA双链接头，所述二代高通量测序的不对称DNA双链接头由两个DNA寡核苷酸单链组成，其制备方法如下：

将所述DNA寡核苷酸单链溶于淬火溶液中，调整最终浓度达到2mM，体积20微升，然后利用下述条件进行淬火反应，形成局部互补的DNA双链接头：在95℃中5分钟；95℃降到12℃，每秒0.1℃；保持在12℃，将退火后的接头溶液1∶4稀释到500μM，并在-20℃保存。

上述两个DNA寡核苷酸单链可采用如下标记序列，从而形成3个不同的、局部互补的DNA双链接头，Y1-ACGAGTGCGT，Y2-AGCGTCGACT，Y3-TGACGCACCT。

同时，本发明还提供了一种应用该二代高通量测序的不对称DNA双链接头的建库方法，其采用如下流程：

A、不对称DNA接头与DNA样本的连接反应：

DNA样本片段使用雾化方法打断后，经Qiagen MinElute PCR纯化试剂盒纯化后，经过末端修复并5’磷酸化后，利用Klenow DNA聚合酶和dATP加入3’A-尾端，然后对形成的3’A-尾端DNA样品和前述的不对称DNA双链接头连接；

B、电泳割胶纯化分离未连接的DNA双链接头：

对连接反应后的DNA样本，先经Qiagen MinElute PCR纯化试剂盒纯化后，再用2.0％的琼脂胶进行电泳分离，割取400-800bp位置的包含DNA的琼脂胶块，利用QIAquick Gel Extraction Kit对DNA进行回收；

C、判断

如回收的DNA定量大于10纳克，可以直接进入454的emPCR反应步骤，进而进行测序；如回收的DNA数量不足于直接进入454的emPCR步骤，也可通过下述的步骤D进行PCR放大，然后电泳割胶纯化去除PCR未反应的DNA引物，最后进入454的emPCR反应步骤；

D、基于不对称序列的PCR放大反应：

用B步骤的回收DNA为模板，用下述两个寡核苷酸单链引物