[发明专利]一种二代高通量测序的不对称DNA双链接头及其应用

权利要求书

1.一种二代高通量测序的不对称DNA双链接头，其特征是：所述二代高通量测序的不对称DNA双链接头由两个DNA寡核苷酸单链组成，其制备方法如下：

将所述DNA寡核苷酸单链溶于淬火溶液中，调整最终浓度达到2mM，体积20微升，然后利用下述条件进行淬火反应，形成局部互补的DNA双链接头：在95℃中5分钟；95℃降到12℃，每秒0.1℃；保持在12℃，将退火后的接头溶液1∶4稀释到500μM，并在-20℃保存。

2.根据权利要求1所述的二代高通量测序的不对称DNA双链接头，其特征是：所述两个DNA寡核苷酸单链采用如下标记序列：

3.一种应用权利要求1所述的二代高通量测序的不对称DNA双链接头的建库方法，其特征是：所述建库方法采用如下流程：

A、不对称DNA接头与DNA样本的连接反应：

DNA样本片段使用雾化方法打断后，经Qiagen MinElute PCR纯化试剂盒纯化后，经过末端修复并5’磷酸化后，利用Klenow DNA聚合酶和dATP加入3’A-尾端，然后对形成的3’A-尾端DNA样品和前述的不对称DNA双链接头连接；

B、电泳割胶纯化分离未连接的DNA双链接头：

对连接反应后的DNA样本，先经Qiagen MinElute PCR纯化试剂盒纯化后，再用2.0％的琼脂胶进行电泳分离，割取400-800bp位置的包含DNA的琼脂胶块，利用QIAquick Gel Extraction Kit对DNA进行回收；

C、判断

如回收的DNA定量大于10纳克，可以直接进入454的emPCR反应步骤，进而进行测序；如回收的DNA数量不足于直接进入454的emPCR步骤，也可通过下述的步骤D进行PCR放大，然后电泳割胶纯化去除PCR未反应的DNA引物，最后进入454的emPCR反应步骤；

D、基于不对称序列的PCR放大反应：

用B步骤的回收DNA为模板，用下述两个寡核苷酸单链引物

PA：5’-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTC-3’70C

PB：5’-CCTATCCCCTGTGTGCCTTGGCA-3’66C

对DNA模板进行10-30个循环PCR放大反应。

4.根据权利要求3所述的一种应用二代高通量测序的不对称DNA双链接头的建库方法，其特征是：在所述流程A中，3’A-尾端DNA样品和不对称DNA双链接头连接的条件是：0.1μg DNA/μl；20μM不对称接头；2mMATP；1/20的T4 DNA连接酶；保温在14°超过6小时。

5.根据权利要求3所述的一种应用二代高通量测序的不对称DNA双链接头的建库方法，其特征是：在所述流程D中，所述PCR放大反应所采用的溶液为：2μM PA引物2μM PB引物1x Phusion Master Mix。

6.根据权利要求3所述的一种应用二代高通量测序的不对称DNA双链接头的建库方法，其特征是：在所述流程D中，PCR放大反应的所采用温度条件如下：第1步：在98℃中30秒；第2步：在98℃中10秒；第3步：在65℃中45秒；第4步：在72℃中30秒；第5步：重复第2-4步10-30次；第6步：在72℃中5秒；第7步：保持在4℃中。